Phương pháp sắc ký khí là phương pháp phân tích được sử dụng nhiều nhất để xác định HCBVTV do tính ưu việt của chúng về độ nhạy, khả năng
phân giải cao. Sắc ký khí trở thành phương pháp phân tách nhanh và hiệu quả
một số lượng lớn các hợp chất bền nhiệt, dễ bay hơi. Đầu dò bắt điện tử
(ECD) và ứng dụng phân tích HCBVTV là loại đầu dò lần đầu tiên được đưa
vào sử dụng do J.lovelock và J.R. Lipsky năm 1960. Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu sử dụng GC-ECD để xác định HCBVTV. Nghiên cứu của Trần Việt Hùng đã xác định đồng thời 18 hoạt chất hoá chất trừ sâu nhóm cơ clo,
cơ photpho và pyrethroid trong 66 mẫu dược liệu bằng phương pháp sắc ký khí sử dụng chiết lạnh hoặc chiết Shoxlet kết hợp phân tích bằng detector bắt
điện tử (ECD), detector khối phổ MS và detector nitơ – photpho (NPD).
Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp ở mức nanogam hoặc dưới nanogam,
độ thu hồi các chất đều ≥ 70%. Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự đã sử
dụng đồng thời GC-ECD và GC-MS đểxác định các HCBVTV nhóm clo hữu
cơ; HPLC và sắc ký khí quang hóa ngọn lửa (GC-FPD) để xác định các HCBVTV cơ photpho trong rau tại một số địa phương ở Hà Nội. Ngày nay,
đã có nhiều loại detector của GC có thể ứng dụng để phân tích HCBVTV
nhưng trong đó MS là detector có ưu điểm vượt trội.
Phương pháp khối phổđãđược phát minh vào khoảng những năm 1980 với mục đích ban đầu là dùng để định tính. Nhưng vào những thập niên sau 1990, thiết bị này đãđược cải tiến tới độ nhạy đủ tốt đểđáp ứng việc định tính
cũng như định lượng. Từ đó dẫn tới cuộc cách mạng trong việc xử lý mẫu phân tích, giúp giảm số lần phân tích do việc sử dụng nhiều loại đầu dò. Ngoài ra, với độ chọn lọc cao, việc sử dụng đầu dò khối phổ kết hợp với phương pháp sắc ký cho phép đơn giản hoá quy trình xử lý mẫu mà không cần trải qua nhiều bước làm sạch nền mẫu như trước đây.
Đầu dò khối phổ, với các thành phần cơ bản như Hình 1.3, là thiết bị
phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [21].
Hình 1.3: Sơ đồ khối của một đầu dò khối phổ
Các kỹ thuật ion hoá trong đầu dò khối phổ ghép nối với phương pháp sắc ký được phát triển thành nhiều loại, thích hợp với tính chất đa dạng của các hợp chất. Trong nghiên cứu này, phương pháp GC sẽ tiến hành ion hoá bằng kỹ thuật Electron Impact (EI). Kỹ thuật phân tích khối là khối phổ hai lần, trong đó sử dụng một nguồn ion hoá ban đầu và hai bộ tách khối được liên kết bởi một vùng tạo ion thứ cấp.
Kỹ thuật EI được sử dụng để ion hoá các hợp chất trung hoà và dễ bay hơi trong một buồng chân không, được gia nhiệt, thích hợp để kết nối với phương pháp GC. Các bộ phận cơ bản của EI được thể hiện ở Hình 1.4. Sự
ion hoá xảy ra dựa vào sự trao đổi năng lượng khi hợp chất va chạm với chùm tia electron được tạo ra từ filament được gia nhiệt. Chùm tia electron này có năng lượng vào khoảng 5 đến 100 eV và 70eV được xem là giá trị năng lượng chuẩn để ion hoá mẫu cho việc ghi nhận tín hiệu khối phổ. Hầu hết các hợp chất hữu cơ sẽ bị ion hoá ở mức năng lượng từ 7 đến 20 eV nên nguồn năng lượng 70 eV sẽ đủ để tạo ra sự phân mảnh đối với các hợp chất đó. Ngoại trừ
các hợp chất có ái lực electron lớn và rất ít các ion âm bền được hình thành
đối với kỹ thuật EI nên EI được xem là nguồn ion hoá dương [22].
Hình 1.4: Sơ đồđiển hình của bộ phận ion hoá EI
Các mảnh ion sau khi được tạo ra sẽ đi vào bộ phân tách khối để tiến hành tách các ion theo tỷ lệ m/z. Bộ phân tách khối dùng trong nghiên cứu này là tứ cực gồm bốn thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống
để các ion bay qua. Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này
Hai thanh trụđối diện nhau được áp một thế bao gồm thế một chiều có
độ lớn là U và thế xoay chiều Vcos( t), trong đó V là thế xoay chiều và là tần số. Độ lớn của thế áp vào sẽ là U+Vcos( t). Mỗi cặp luôn được áp thế trái
điện tích với nhau, nhưng cùng độ lớn, nghĩa là một cặp trụ sẽ có thế
+(U+Vcos( t)) (dấu “+” trên Hình 1.5) và cặp còn lại là -(U+Vcos( t)) (dấu
“-“ trên Hình 1.6) [23]. Các ion đi vào bộ tách khối sẽ dao động trong điện trường được tạo thành từ bốn thanh trụ. Chuyển động của nó phụ thuộc vào tỷ
lệ m/z của bản thân ion, thế một chiều và xoay chiều cũng như tần số của thế
xoay chiều và chỉ những ion có tỷ lệ m/z thích hợp mới có thể đi qua bộ tứ
hút ra ngoài. Kỹ thuật tứ cực được xem là đơn giản, chi phí thấp và dễ dành vận hành
Hình 1.5: Sơđồ một bộ tách khối tứ cực
Để có thể phân tích cấu trúc và định lượng các hợp chất ở hàm lượng thấp trong một nền mẫu phức tạp, thiết bị tách khối với sự kết hợp của ba bộ
tứ cực đã được phát triển (Hình 1.6). Trong đó, bộ tứ cực thứ nhất và thứ ba có khả năng chọn lọc ion, bộ tứ cực giữa sẽ có nhiệm vụ như phần tạo ra các ion thứ cấp từ những ion đi ra từ bộ tứ cực đầu tiên. Với khả năng này, bộ ba tứ cực sẽ cải thiện khả năng nhận biết chất phân tích do có được nhiều dữ liệu hơn về cấu trúc chi tiết hoặc các nhóm chức đặc trưng của từng hợp chất. Việc đi qua hai bộ tách khối cũng làm tăng số lượng ion thích hợp có được từ
hợp chất phân tích, làm tăng tín hiệu đến đầu dò và cải thiện tín hiệu S/N (signal-to-noise) [22].
Hình 1.6: Cấu tạo cơ bản của một đầu dò khối phổ ba tứ cực
Mặc dù sắc ký lỏng (LC) không quá phổ biến để phân tích OCPs,
nhưng nó được sử dụng trong trường hợp các hợp chất có độ bay hơi kém, độ
detector thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký lỏng là detector diode array (DAD), detector quang và detector khối phổ (MSD). Việc sử dụng pha
động để phân tích hoá chất BVTV trong kỹ thuật sắc ký lỏng bao gồm hỗn hợp acetonitrile (MeCN) –nước hoặc hỗn hợp methanol (MeOH) –nước. Một số OCPs có thểđược xác định theo phương pháp sinh học (ELISA)
hay phương pháp điện cực màng sinh học (Biosensor) hoặc theo phương pháp
cực phổ. Tuy nhiên, các phương pháp này khó có thể xác định một hoá chất BVTV cụ thể mà chỉ có thể xác định sự có mặt của một nhóm chất, do đó, thường sử dụng trong công tác sàng lọc, đánh giá sơ bộ.
Một số phương pháp phân tích cụ thể đã được các tác giả sử dụng để
phân tích OCPs trong mẫu gạo. Được chúng tôi tóm tắt dưới Bảng 1.3 sau
đây:
Bảng 1.3: Một sốphương pháp phân tích OCPs trong mẫu gạo
STT Cách tiến hành LOD/LOQ (µg/kg) Tài liệu tham khảo Chiết Làm sạch Phân tích 1 Chiết với dung môi DCM Làm sạch bằng cột nhồi Florisil, rửa giải bằng hỗn hợp n- hexan/axeton (4:1, v/v) GC-MS LOD: 0,26-87 [24] 2 QuEChERS d-SPE với 375 mg PSA and 750 mg MgSO4 khan GC- MS/MS LOD: 0,1-7,0 LOQ: 0,4- 26,3 [25] 3 Chiết với axeton- metanol (1: 1, Làm sạch bằng cột nhồi hỗn hợp Al2O3 và than hoạt tính (15:1, GC- ECD LOD: 2- 5 [26]
STT Cách tiến hành LOD/LOQ (µg/kg) Tài liệu tham khảo Chiết Làm sạch Phân tích v/v) và DCM w/w), rửa giải với DCM
4 QuEChERs d-SPE 50mg PSA, 300mg MgSO4 và 20mg GCB GC– MS-SIM LOQ: 2-50 [27] 5 Mẫu được trộn với Celite 545 và chiết dung môi nhanh (ASE) với ACN Làm sạch bằng cột chiết pha rắn Envi-18, Envi-Carb và Sep-Pak NH2, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi ACN/Toluene(3:1,v/v) GC-MS LOD: 0,5– 300 [28] 7 QuEChers 25 mL nước / ACN (1,5:1, v/v) và hỗn hợp muối MgSO4 / NaCl (4: 1, w / w) d-SPE với 150 mg PSA, 50mg C18 và 750 mg MgSO4 khan GC- TOF/MS [29]
Nhận xét phần nghiên cứu tổng quan: Từ các thông tin và dữ liệu được trình bày phần tổng quan, học viên nhận thấy:
- Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu, công bố liên quan đến xây dựng phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật cơ clo trong gạo
- Phương pháp sắc ký khí khối phổ là phương pháp đã được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn với ưu điểm vượt trội về khả năng xác định chính xác
đồng thời OCPs với độ nhạy cao trong các nền mẫu phức tạp.
- Trong nghiên cứu này, học viên lựa chọn kỹ thuật GC-MS/MS để xây dựng và phát triển quy trình phân tích đồng thời 19 OCPs trong mẫu gạo. Phương pháp này được xác nhận và đánh giá trước khi áp dụng đểđánh giá dư lượng
của OCPs trong một số mẫu gạo. Kết quả của nghiên cứu này chính là cơ sở
cho việc nghiên cứu xác định dư lượng của HCBVTV cơ clo trong gạo cũng
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ2.1.1.1. Thiết bị 2.1.1.1. Thiết bị
* Thiết bị GC-MS/MS
- Hệ thống thiết bị sắc ký khí khổi phổ hai lần (Thermo Scientific, USA) bao gồm máy sắc ký khí (Trace 1300/1310), bộ phận bơm mẫu tự động (Triplus RSH) ghép nối với phần khối phổ TSQ 9000.
- Cột phân tích HP5-MS có chiều dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm,
độ dày lớp phim tráng là 0,25 m của Agilent (Mỹ).
* Các thiết bị khác
- Cân phân tích (độ chính xác 0,1mg) - Tủ sấy
- Máy cất nước khử ion - Thiết bị Votexer
- Thiết bị ly tâm Universal 320 (Hittich) - Bể siêu âm: Model S100H, hãng ELMA, Đức - Bộ chiết pha rắn: Model VM-12, hãng Agela, Mỹ - Bộ cô khí Nito: Model DBG-002, hãng MRC Ltd, Israel
- Bộ ly tâm chân không: Model miVac Quattro, hãng SP Scientific, Mỹ
2.1.1.2. Dụng cụ
- Vial loại 2 ml
- Pipetman các loại từ 0-1000 µl và đầu típ tương ứng - Các bình định mức: 25, 50, 100ml
- Ống falcon 15, 50ml
- Các dụng cụthông thường khác của phòng thí nghiệm
2.1.2. Hóa chất 2.1.2.1. Chất chuẩn 2.1.2.1. Chất chuẩn
- Hóa chất OCPs chuẩn 10 mg/L (10 ppm) là hỗn hợp Pesticide-mix 19 chuẩn dùng cho các phép đo sắc ký khí. Hỗn hợp chuần bao gồm: Alpha- HCH, Beta-HCH, Gamma-HCH, Delta-HCH, Heptachlor, Aldrin, Chlordane
cis, α-Endosulfan, Chlordane trans, pp' DDE, Dieldrin, Endrin, β- Endosulfane, pp' DDD, Endrin Aldehyde, Endosulfane Sulfate, Endrin Keton, Methoxychlor. Dung dịch được bảo quản ở -20oC
2.1.2.2. Hóa chất
- N-hexan (Merck, Đức) - Toluene (Merck, Đức) - Axit axetic (Merck, Đức)
- MgSO4khan, NaCl (Merck, Đức)
- Chất hấp phụ PSA (Primary secondary amine) (Agilent, Mỹ) - Chất hấp phụ C18 (Agilent, Mỹ)
2.1.2.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc nồng độ 1 mg/L: Lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 mg/L và định mức 10 mL với dung môi n- hexan. Dung dịch được bảo quản ở -20oC.
Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 µg/L được pha từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/L trong dung môi n-hexan. Các dung dịch này chỉđược pha trước khi sử dụng.
2.1.2.4. Chuẩn bị mẫu chuẩn
- Mẫu dung dịch chuẩn: được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc và được sử dụng cho quá trình so sánh đánh giá hiệu suất thu hồi cũng như khảo sát các điều kiện chạy máy GC-MS/MS.
- Mẫu trắng: là mẫu gạo được xác định không có HCBVTV. Mẫu được làm khô tự nhiên tại nhiệt độ phòng, nghiền và cho qua rây 2mm. Mẫu được bảo quản tại 4oC và được dùng làm nền cho các khảo sát quá trình chiết tách, làm sạch trên nền mẫu thật.
- Mẫu chuẩn trên nền trắng là mẫu được pha từ dung dịch chuẩn và dịch chiết của mẫu trắng theo quy trình xử lý mẫu dự kiến.
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.2.1. Tối ưu điều kiện phân tích trên hệ GC-MS/MS
Các nghiên cứu, khảo sát lựa chọn điều kiện vận hành thiết bị GC- MS/MS gồm:
- Nhiệt độ cổng bơm mẫu và tốc độbơm mẫu, - Thểtích bơm mẫu và tốc độ khí mang
- Chương trình nhiệt độ
- Lựa chọn mảnh phân tách định tính và định lượng
Trong các khảo sát này, dung dịch chuẩn sẽ được đưa vào thiết bị GC- MS/MS với các điều kiện khảo sát khác nhau và từ đó lựa chọn ra điều kiện phù hợp nhất cho xây dựng qui trình phân tích.
2.2.2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu
Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu tập trung vào khả năng thu được tối đa chất phân tích ở dịch chiết cuối cùng, được thể hiện qua thông số độ thu hồi của chất phân tích. Để đạt mục đích trên, nghiên cứu tập trung tối ưu bốn thông số của quy trình gồm: dung môi chiết, quá trình bay hơi dung môi, loại chất hấp phụ được sử dụng ở bước làm sạch và thể tích dung môi rửa giải. Trong quá trình xử lý mẫu, có khả năng cao xuất hiện các chất được chiết
đồng thời với chất phân tích, tạo ra ảnh hưởng nền làm tăng hoặc giảm tín hiệu của OCPs ở hệ thống khối phổ. Để giảm thiểu ảnh hưởng nền đến kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu, độ thu hồi được tính theo hiệu suất phần trăm (%) giữa tín hiệu từ mẫu khảo sát trên tín hiệu mẫu chuẩn trên nền trắng. Mẫu khảo sát là mẫu được thêm chuẩn trước khi thực hiện quy trình xử lý mẫu theo thông số cần khảo sát. Mẫu chuẩn trên nền trắng là mẫu được pha từ
dung dịch chuẩn và dịch chiết của mẫu trắng gạo theo quy trình xử lý mẫu dự
kiến.
2.2.2.1. Dự kiến quy trình xử lý mẫu
Để giảm thiểu hiệu ứng nền và tăng hiệu quả chiết thay vì kết hợp chiết xuất QuEChERS và làm sạch d-SPE thông thường, tôi lựa chọn SPE cho
bước làm sạch dịch chiết. Dựa trên nghiên cứu xác định hóa chất BVTV trong chè của Lý Tuấn Kiệt và công sự [30], quy trình xử lý mẫu dự kiến xác định OCPs trên nền mẫu gạo như sau :
Bước 1. Cân 2 g mẫu gạo cho vào ống Falcon 50 mL.
Bước 2. Thêm 5ml nước deion và 10 mL ACN (1% axit axetic) và vào
ống Falcon 50 mL. Lắc vortex trong 1 phút và lắc 30 phút.
Thêm muối EN 15662 QuEChERS (1g NaCl, 4 g MgSO4, 1g Na3Citrate, 0,5g Na2HCitrate)
Lắc vortex trong 1 phút.
Bước 3. Lấy ống Falcon ly tâm trong 10 phút với tốc độ 4500
vòng/phút.
Bước 4. Hút 5 mL dung dịch (lớp dung môi phía trên) và cho đi qua cột được chiết pha rắn SPE để làm sạch
Bước 5. Rửa giải bằng 20ml ACN-Toluenen (3:1, v/v). Thu thập dung dịch chiết và dung dịch rửa giải
Bước 6. Ly tâm chân không dung dịch đến ~5 mL, sau đó làm khô dưới
dòng khí N2 ở nhiệt độ thấp. Hòa tan cắn trong 1 mL n-hexan rồi đem phân tích bằng GC-MS/MS.