Trái với phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi, tách các hợp chất tự
nhiên nhờ vào mức độ phân cực của chúng, phương pháp ứng dụng enzyme sử
dụng nước là dung môi đặc biệt để hòa tan, phá vỡ các rào cản giải phóng hoạt chất đang bịlưu giữ trong mạng lưới lignocellulose một cách tự nhiên (Hình 1.8).
Hình 1.8. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose [75] Hình 1.8, miêu tả quá trình chiết xuất hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose thành tế bào thực vật (chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin). Quá trình phân giải chất nền (matrix, ma trận) của thành tế bào đã thúc đẩy quá trình giải phóng các hoạt chất được dễ dàng và thuận lợị
Trong củ nghệ hàm lượng cacbohydrate bao gồm tinh bột, cellulose, monosaccarit và dextrin chiếm 70% theo khối lượng củ [75]. Trong thập kỷ qua,
đã có sự chuyển dịch từ phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid sang sử dụng enzyme chuyển hóa tinh bột trong sản xuất maltodextrin, tinh bột biến tính, dịch
đường glucose và fructosẹ Chuyển hóa tinh bột bằng enzyme cũng được sử dụng trong các ứng dụng thực phẩm khác, trong đó amylase là một trong những enzyme chủ yếu, thủy phân tinh bột thành các phân tử nhỏhơn như glucosẹ Trên thế giới,
đã có một số nghiên cứu tiền xử lý enzyme cho quá trình chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ, tuy nhiên, kết quả mới đạt bước đầụ Ở trong nước chưa có nghiên
cứu sử dụng kết hợp thủy phân enzyme trong quy trình chiết xuất curcuminoid từ
Nilesh Kurmudle và cộng sự(2013) đã nghiên cứu chiết xuất nhựa dầu nghệ
với sự hỗ trợ của enzyme sử dụng aceton làm dung môị Các enzym được sử dụng
để tiền xử lý nghệ trước khi chiết xuất dung môi là α-amylase, glucoamylasẹ Kết quả hàm lượng curcuminoid của nghiên cứu xử lý nghệtrước khi sử dụng enzyme và sau khi tiền xử lý bằng α-amylase, glucoamylase tăng từ là 3,11% lên đến 3,92%; 4,1% [76].
Foozie Sahne và cộng sự (2016) đã nghiên cứu quy trình chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ nguyên sơ bằng cách sử dụng dung môi N,N-Dipropyl ammonium N,N-dipropylcarbamate (DPCARB) đạt 3,58%. Sau khi tiền xử lí bằng hệ enzyme α-amylase và γ-amylase hàm lượng đã tăng lên đáng kể là 5,73% [77].
Yogita P. Labrath và cộng sự (2017) đã nghiên cứu quy trình chiết xuất curcuminoid bằng cách sử dụng α-amylase đạt hiệu suất là 51%, độ tinh khiết lên
đến 95% so với hiệu suất khi không dùng enzyme là 43,8% [78].
Tóm lại, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sử dụng phương án enzyme bước
đầu đã cho hiệu quả cao và tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp, cho phép tạo ra các công nghệ mới sử dụng các hóa chất thân thiện với môi trường, tiết kiệm về năng lượng và chi phí. Ứng dụng công nghệ enzyme thường cho kết quả là giảm thời gian chiết, giảm thiểu việc sử dụng các dung môi và tăng năng suất và chất lượng của sản phẩm. Vì vậy, nghiên cứu quy trình chiết xuất curcuminoid từ
củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) kết hợp với công nghệ enzyme thân thiện môi
trường là khả quan và là hướng phát triển công nghệ chiết xuất xanh – sạch đang
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hình 2.1. Củ nghệ vàng (Curcuma longa L.)
Mẫu củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) thu tại Nghệ An được giám định tên khoa học và lưu giữ trên bản tại nhóm Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh
dược, phòng Hệ gen học chức năng – Viện nghiên cứu hệ gen.
2.2. Hóa chất và thiết bị
Enzyme
α-amylase có hoạt độ 2000UI/g, cung cấp bởi công ty Biogreen của Việt Nam với khoảng hoạt động là pH 5,0-7,0; nhiệt độ 40-85oC.
Cellulase có hoạt độ 2000UI/g, cung cấp bởi công ty Biogreen của Việt Nam với khoảng hoạt động là pH 4,5-7,5; nhiệt độ 20-70oC.
Hóa chất
Methanol, acid formic, acetonitrilẹ.. đạt tiêu chuẩn phân tích trong phòng thí nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Đềtài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:
2.3.1. Thu mẫu thực vật
Các mẫu nghệ được lấy ở2 vùng Tương Dương và Nam Đàn tại Nghệ An, Việt Nam, sau đó mẫu được tiến hành xử lý mẫu để bảo quản và lưu mẫụ Các mẫu nghệ được bóc vỏ, rửa sạch và thái lát 3 mm sấy khô ở 60oC (tránh điều kiện ánh sáng) đến khi đạt hàm ẩm <12% (để bảo quản). Nghệ lát khô được xay thành bột có cỡ hạt khoảng 0,5 mm rồi được mã số kí hiệụ
2.3.2. Phương pháp xác định độẩm
Độẩm được xác định theo TCVN 4295:2009.
Định nghĩa: Hàm lượng ẩm của củ nghệ là phầm trăm của khối lượng mất
đi sau khi sấy ở 105oC cho đến khi khối lượng không thay đổị
0,0005 g mẫu cho vào đĩa, đậy nắp, cân lại đĩa và ghi khối lượng (m1). Đặt đĩa và
nắp vào tủ sấy (không đậy nắp lên dĩa) và sấy trong 4 giờở 105oC ± 2oC. Sau khi sấy lấy nắp đậy dĩa lại và chuyển qua bình hút ẩm để làm nguội và cân ghi khối
lượng là (m2).
Tiếp tục sấy mẫu (phải mở nắp) trong 1 giờ ở 105oC ± 2oC. Thực hiện lại
bước thứ 3 và cân lại khối lượng (m2). Lặp lại bước 4 và 5 đến khi nào sự chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg thì dừng lạị
Tính kết quả
Hàm lượng ẩm được tính như sau:
m0: khối lượng nắp và dĩa (g).
m1: khối lượng nắp + dĩa + mẫu (g).
m2: khối lượng nắp + dĩa + mẫu sau khi sấy khô (g).
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần
Hàm lượng tro toàn phần được xác định theo TCVN 9939:2013.
Định nghĩa: Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm đã oxi
hóa (do đó tro còn được gọi là tro tổng số muối khoáng). Trong trường hợp thực phẩm có lẫn các chất bẩn (đất, cát) muốn có độ tro thật sự phải loại trừ đất cát và những chất không phải là muối khoáng mà lại không nung cháy ở nhiệt độ quy
định.
Cách tiến hành: Cân 5g mẫu chính xác tới 0,0001g vào chén nung bằng sứ
có nắp đã nung đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng. Đậy nắp chén
nung và đốt sơ bộ trên bếp điện. Sau khi mẫu đã cháy thành than, chuyển chén nung chứa mẫu sang lò nung ở nhiệt độ 600- 700oC.
Mẫu được tro hóa tới màu trắng xám hoặc vàng nhẹ, lấy kẹp gắp chén nung
đặt trong bình hút ẩm khỏang 40 phút, cần xác định khối lượng chén nung chứa tro của mẫu chính xác tới 0,0001g.
Tính kết quả: hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: (G2– G) *100
(G1 –G) X1 =
G: Trọng lượng của chén tính bằng gam.
G1: Trọng lượng của chén và trọng lượng của mẫu thử tính bằng gam. G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng tro trắng sau khi đã nung và cân
tới trọng lượng không đổi tính bằng gam.
2.3.4. Xác định hàm lượng carbohydrate
Hàm lượng carbohydrate được xác định bằng phương pháp axit phenol- sulfuric [79].
Nguyên tắc: Dùng axit sunfuric đặc để khử nước, tạo ra các dẫn xuất furfural. Phản ứng tiếp theo giữa các dẫn xuất furfural và phenol tạo ra màu có thể tách rờị
Tiến hành: Lấy 1g mẫu trộn với 2 ml dung dịch phenol 5% trong một ống nghiệm. Tiếp theo ta thêm nhanh 5 ml axit sulfuric đặc. Đểống nghiệm yên trong 10 phút, tiếp theo lắc nhẹ trong 30s và được đặt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ phòng 20 phút để màu phát triển. Sau đó, lấy dung dịch đo trên máy quang phổở bước sóng 490 nm. Các dung dịch đối chiếu được chuẩn bị theo cách tương tự như trên nhưng thay 2 ml dung dịch carbohydrate bằng dung dịch miliporẹ Phenol
được sử dụng trong quy trình này đã được chưng cất lại và 5% phenol trong nước
(w/w) đã được chuẩn bịngay trước khi đọ
2.3.5. Xác định hàm lượng và thành phần curcuminoid bằng HPLC
2.3.5.1. Xác định hàm lượng cao chiết tổng
Phương pháp chiết Soxhlet
Phương pháp chiết Soxhlet theo F. Soxhlet năm 1879 sau đó vào năm 1974, Edward Randall đã thực hiện một cải tiến lớn trong kỹ thuật chiết Soxhlet giúp rút ngắn thời gian chiết [80]. Theo Manal Ạ Hamed (2019), việc chiết xuất sử
dụng dung môi methanol là tối ưu nhất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn methanol là dung môi chiết. Để phù hợp trong quá trình chiết xuất bằng máy Ser148/3 Velp với dung môi chiết methanol, chúng tôi khảo sát các thông sốcài đặt cho máy bao gồm nhiệt độ chiết, thời gian ngâm mẫu (Immersion), thời gian chiết mẫu (Washing), thời gian cô đặc (Removing).
Sau quá trình khảo sát chúng tôi đưa ra quy trình tiền xử lí mẫu nghệ và chiết xuất thu cao tổng như sau:
Cân 5,00g bột nghệ gói bằng giấy lọc; Sử dụng 70ml dung môi methanol;
+ Nhiệt độ 170oC + Immersion 90 phút + Washing 360 phút + Removing 30 phút
Thu được m’cao chiết tổng.
Phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm
Mẫu bột nghệ khô được ngâm chiết với methanol theo tỉ lệ 1:3 (g/ml) sau đó cho vào máy siêu âm, phân lập trong 1,5 giờ, nhiệt độ 35oC với công suất 200W. Mẫu sau khi phân lậpđược để nguội đến nhiệt độ phòng và lọc dịch chiết 1 qua giấy lọc. Thực hiện tương tự thêm 2 lần nữạ
Gom các dịch chiết đi cô quay thu được cao tổng. Hàm lượng cao tổng được tính bằng công thức:
𝑊𝑜= 𝑚′
𝑚𝑜× 100%
Trong đó:
mo là khối lượng mẫu khô ban đầu m’ là khối lượng mẫu cao tổng thu được
2.3.5.2. Thiết lập đường chuẩn định lượng curcuminoid bằng HPLC
Định lượng BDMC: Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của
BDMC được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 18,2 – 19,4 phút đối với các mẫu chất chỉ thịdùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của BDMC tại thời điểm 18,3–19,5 phútvới pic ion phân tử 309,0 [M+H]+. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 425 nm tại thời gian lưu Rt 18,2–19,4 phút.
Định lượng DMC: Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của DMC
được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 19,7–21,2 phút đối với các mẫu chất chỉ thị dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện
được pic ion phân tử của DMC tại thời điểm 19,8–21,3 phút với pic ion phân tử
339,0 [M+H]+. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 425 nm tại thời gian lưu Rt 19,7–21,2 phút.
Hình 2.2. Sắc ký đồ của curcuminoid
Định lượng curcumin: Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của curcumin được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 21,3 – 23,3 phút
đối với các mẫu chất chỉ thịdùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của curcumin tại thời điểm 21,4 – 23,4 phút với pic ion phân tử 369 [M+H]+. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 425 nm tại thời gian lưu Rt 21,3–
23,3 phút.
2.3.6. Phương pháp định lượng đường khử và tinh bột
Định lượng đường khử và tinh bột bằng DNS theo phương pháp của Miler 1959 [81].
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc phản ứng tạo màu giữa glucose với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường glucose trong một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng
phương pháp đo quang ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng glucose tự do sinh ra trong mẫu thí nghiệm.
Tiến hành: Cân 1g mẫu vào bình tam giác, bổ sung vào bình 100ml HCl
5%. Đun cách thủy mẫu trong 1 giờ. Để nguội, nhỏ vào 4-5 giọt dung dịch methyl
da cam sau đó dùng NaOH 20% để trung hòa acid tới khi dung dịch đổi màu (từ
hồng sang vàng). Lọc bằng giấy lọc để thu dung dịch trong.
Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường
Hàm lượng glucose được khảo sát từ nồng độ 50-100 µg/ml, đường chuẩn glucose thể hiện qua hình 2.3. min 0 5 10 15 20 25 mAU -25 0 25 50 75 100 125 150 175
DAD1 A, Sig=428,8 Ref=360,100 (CURCUMIN\20040703.D)
3 .0 00 6 .1 87 6.704 11. 59 1 1 2. 17 4 1 8. 79 0 2 0. 23 3 2 1. 79 8
Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn glucose (µg/ml)
Nồng độ glucose tự do của mẫu được tính theo phương trình: y = 0,0173x- 0,683 (R2 = 0,9971). Trong đó x là nồng độ glucose của mẫu, y là giá trị quang phổ OD540.
Tính kết quả
Từ phương trình đồ thịđường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử
trong dung dịch ở các ống nghiệm.
Hàm lượng glucose trong nguyên liệu được tính theo công thức:
𝐺 = 𝑋. 𝑉. 1001000. 𝑚 . 𝑓𝑚ẫ𝑢(%)
Trong đó:
m là lượng mẫu đem thí nghiệm (g);
V là thểtích định mức dung dịch thí nghiệm (ml);
X là nồng độđường khử trong dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml); fmẫu là hệ số pha loãng mẫu;
Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thủy phân thành đường glucose, xác
định lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 sẽ được hàm lượng tinh bột. (CH10O5)n + n H2O → n C6H12O6
162,1 18,02 180,12 F = 180,12
162,1 = 0,9
Từ đó ta tính được hàm lượng tinh bột: X = G x 0,9.
Trong đó:
G là hàm lượng glucose trong mẫu phân tích (%);
X là hàm lượng tinh bột trong mẫu phân tích (%);
2.3.7. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 300 µL CMC 1% (trong đệm natri acetate 0,05M; pH 5,0) với 150 µL dịch enzyme thô được ủ ở 50oC trong 30 phút. Ngừng phản
màụ Đo độ hấp phụ quang của sản phẩm tạo thành ởbước sóng 540 nm. Một đơn
vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác
chuyển hóa 1 µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [82]. Hàm lượng
glucose được tính toán theo phương trình đường chuẩn: y = 0,562x (R2 = 0,962)
Trong đó: y là nồng độ glucose x là OD540 nm
Hàm lượng protein tổng số của dịch chiết được xác định theo phương pháp
Bradford (1976) theo quy trình vi phân tích dựa vào đường chuẩn albumin huyết thanh bò (BSA). Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng cách chia hoạt độ
chung (unit/mL) cho protein tổng số (mg/mL).
2.3.8. Phương pháp thủy phân nghệ bằng enzyme
Phương pháp thủy phân nghệ bằng enzyme được xây dựng bởi nhóm Nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh – dược, phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ gen, phát triển từ các nghiên cứu trước đây (Sahne, 2017).
Tiến hành: Mẫu nghệ nguyên liệu được xay nhỏ, lấy 50 g cho vào bình phản
ứng, rồi thêm một lượng nước theo yêu cầu của mỗi thí nghiệm. Hỗn hợp nguyên liệu và nước được khuấy ở tốc độ 200 vòng/phút và hồ hóa ở 80oC trong 20 phút. Sau khi thêm các enzyme theo tỷ lệ, phản ứng thủy phân được tiến hành ở nhiệt
độ, pH và thời gian khác nhau để xác định điều kiện tối ưụ Quá trình thủy phân
được kết thúc bằng cách tăng nhiệt độ lên 80oC trong 15 phút nhằm bất hoạt enzymẹ Dịch thủy phân sau đó được ly tâm, lấy phần dịch để xác định độ thủy phân (DH) [83].
Tính kết quả:
Độ thủy phân DH (%) được tính theo công thức: DH = (c×V/m) × (162/180) × 100.
Trong đó:
c là nồng độ glucose tự do (µg/ml); V là thể tích phản ứng (ml);
m là khối lượng tinh bột trong mẫu nghệ (µg),;
162/180 là hệ số chuyển đổi giữa mono và polysaccharidẹ
2.3.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm trực giao bậc 2 Box-Wilson
nâng cao độ phù hợp phải có các số hạng bậc 2. Khi đó ta phải tiến hành mô hình hóa thực nghiệm bậc 2. Có nhiều giải pháp tìm phương trình hồi quy bậc 2 nhưng
phổ biến nhất là 2 phương pháp: dùng ma trận tâm trực giao và ma trận tâm xoaỵ Với thực nghiệm có ba yếu tốảnh hưởng, khi tiến hành mô hình hóa thực