Định lượng đường khử và tinh bột bằng DNS theo phương pháp của Miler 1959 [81].
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc phản ứng tạo màu giữa glucose với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường glucose trong một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng
phương pháp đo quang ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng glucose tự do sinh ra trong mẫu thí nghiệm.
Tiến hành: Cân 1g mẫu vào bình tam giác, bổ sung vào bình 100ml HCl
5%. Đun cách thủy mẫu trong 1 giờ. Để nguội, nhỏ vào 4-5 giọt dung dịch methyl
da cam sau đó dùng NaOH 20% để trung hòa acid tới khi dung dịch đổi màu (từ
hồng sang vàng). Lọc bằng giấy lọc để thu dung dịch trong.
Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường
Hàm lượng glucose được khảo sát từ nồng độ 50-100 µg/ml, đường chuẩn glucose thể hiện qua hình 2.3. min 0 5 10 15 20 25 mAU -25 0 25 50 75 100 125 150 175
DAD1 A, Sig=428,8 Ref=360,100 (CURCUMIN\20040703.D)
3 .0 00 6 .1 87 6.704 11. 59 1 1 2. 17 4 1 8. 79 0 2 0. 23 3 2 1. 79 8
Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn glucose (µg/ml)
Nồng độ glucose tự do của mẫu được tính theo phương trình: y = 0,0173x- 0,683 (R2 = 0,9971). Trong đó x là nồng độ glucose của mẫu, y là giá trị quang phổ OD540.
Tính kết quả
Từ phương trình đồ thịđường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử
trong dung dịch ở các ống nghiệm.
Hàm lượng glucose trong nguyên liệu được tính theo công thức:
𝐺 = 𝑋. 𝑉. 1001000. 𝑚 . 𝑓𝑚ẫ𝑢(%)
Trong đó:
m là lượng mẫu đem thí nghiệm (g);
V là thểtích định mức dung dịch thí nghiệm (ml);
X là nồng độđường khử trong dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml); fmẫu là hệ số pha loãng mẫu;
Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thủy phân thành đường glucose, xác
định lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 sẽ được hàm lượng tinh bột. (CH10O5)n + n H2O → n C6H12O6
162,1 18,02 180,12 F = 180,12
162,1 = 0,9
Từ đó ta tính được hàm lượng tinh bột: X = G x 0,9.
Trong đó:
G là hàm lượng glucose trong mẫu phân tích (%);
X là hàm lượng tinh bột trong mẫu phân tích (%);
2.3.7. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 300 µL CMC 1% (trong đệm natri acetate 0,05M; pH 5,0) với 150 µL dịch enzyme thô được ủ ở 50oC trong 30 phút. Ngừng phản
màụ Đo độ hấp phụ quang của sản phẩm tạo thành ởbước sóng 540 nm. Một đơn
vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác
chuyển hóa 1 µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [82]. Hàm lượng
glucose được tính toán theo phương trình đường chuẩn: y = 0,562x (R2 = 0,962)
Trong đó: y là nồng độ glucose x là OD540 nm
Hàm lượng protein tổng số của dịch chiết được xác định theo phương pháp
Bradford (1976) theo quy trình vi phân tích dựa vào đường chuẩn albumin huyết thanh bò (BSA). Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng cách chia hoạt độ
chung (unit/mL) cho protein tổng số (mg/mL).