hexadecen-1-ol MOM ether (dưới)
c) Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol
Khuấy hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (4) (2,04 g; 7,2 mmol) trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol (50 ml) ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, 100ml nước lạnh được thêm vào và hỗn hợp được chuyển sang phễu phân tách để tách lấy phần hữu cơ. Phần hữu cơ được rửa bằng 60 ml dung dịch nước NaHCO3 bão hòa. Phần nước được ly trích tiếp tục bằng 60 ml n-hexane (3 lần). Phần hữu cơ và n-hexane được trộn lại với nhau, lọc qua Na2SO4 thu được hợp chất MOM ether của hợp chất (Z)-11- hexadecen-1-ol đạt hiệu suất phản ứng là 70,8% (1,22 g; 5,1 mmol). Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol được tinh lọc bằng cột sắc ký mở sử dụng Silica gel làm pha tĩnh. Độ tinh khiết đồng phân của sản phẩm đạt >96% được xác định nhờ kỹ thuật GC-MS. RT:0.00 - 57.27 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 32.13 30.41 26.46 33.99 39.93 54.97 39.10 28.38 24.67 35.63 40.28 24.38 48.73 21.62 20.56 2.70 53.04 40.56 4.86 8.30 43.81 49.04 13.30 14.15 NL: 1.93E9 TIC MS SP2
- Dữ liệu GC-MS: Rt: 30,65 phút; MS (m/z): 55 (base), 69, 81, 96, 109, 124, 138, 166, 222 & 240. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,91 (3H, t, J=7.05 HZ), 1,30-1,37 (22H, broad), 1,54-1,63 (2H, tt, J=6,71 Hz, 6,92 Hz), 2,0 (1H, s), 3,60-3,65 (2H, t, J=6,62 Hz) và 5,29-5,39 (2H, m). Phổ 13C NMR (ppm): 14,0, 22,34, 25,73, 26,91, 27,18, 29,29, 29,43, 29,52, 29,55, 29,60, 29,76, 31,95, 32,78, 63,05, 129,86 và 129,88.
Hình 4.4. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (dưới) hexadecen-1-ol (dưới)
4.1.2.2. (Z)-11-hexadecenal
Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (500 mg; 2,1 mmol), PCC (679 mg; 3,15 mmol) và 50 ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó, bình phản ứng được kết nối với hệ thống cô-quay để bay hơi toàn bộ dung môi CH2Cl2. Hỗn hợp còn lại được thêm vào 50 ml n-hexane và 50 ml nước rồi chuyển vào phễu phân tách lắc và tách lấy hữu cơ. Phần nước còn trong
phễu được ly trích tiếp tục với n-hexane (50 ml x 3 lần). Kết hợp dung môi ly trích với phần hữu cơ, rửa với dung dịch nước bão hòa NaHCO3, cô đặc và làm tinh lọc bằng cột sắc ký mở, sử dụng silica gel làm pha tĩnh, thu được hợp chất (Z)-11-hexadecenal (453 mg; 1,9 mmol), đạt hiệu suất phản ứng là 90,5%.
Hình 4.5. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11- hexadecenal (dưới) - Dữ liệu GC-MS: Rt 31,83 phút, MS (m/z): 55 (base), 69, 83, 97, 98, 111, 123, 137, 192, 136, 218 và 236. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,91 (3H, t, J=6,92 HZ), 1,28-1,31 (22H, broad), 1,58-1,64 (2H, tt, J=7.31 Hz, 7,52 Hz), 2,39-2,44 (2H, td, J=7,35 Hz, 1,85 Hz), 5,29-5,39 (2H, m) và 9,75-9,76 (1H, t, J=1,63 Hz). RT:0.00 - 57.28 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 31.84 31.52 33.54 34.30 28.91 27.98 35.13 27.49 36.61 4.10 4.26 39.79 42.13 24.75 6.05 8.04 9.31 20.33 22.95 45.26 49.49 55.16 NL: 1.16E9 TIC MS Sample2K NN30-05- 2017
Phổ 13C NMR (ppm): 14, 22,07, 22,34, 26,90, 27,16, 29,15, 29,25, 29,34, 29,39, 29,45, 29,73, 31,95, 43,91, 129,83, 129,89 và 203,04.
4.1.2.3. (Z)-11-hexadecenyl acetate
Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (500 mg; 2,1 mmol) được khuấy cùng với anhydride acetic (3,0 ml) trong pyridine (15 ml) ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó, bình phản ứng được thêm vào 50 ml n-hexane và 50 ml nước rồi chuyển hỗn hợp sang phễu phân tách, lắc đều, tách lấy phần hữu cơ. Phần nước được ly trích tiếp tục với n-hexane (5 ml x 3 lần). Kết hợp dung môi ly trích với phần hữu cơ, rửa lần lượt với nước lạnh (100 ml), dung dịch HCl 1N (100 ml) và dung dịch bão hòa NaHCO3 (100 ml), cô đặc và tinh lọc bằng cột sắc ký mở sử dụng silica gel làm pha tĩnh thu được hợp chất (Z)-11- hexadecenyl acetate (415 mg; 1,47 mmol), đạt hiệu suất phản ứng là 71,4%.
- Dữ liệu GC-MS: Rt: 31,64 phút; MS (m/z): 55, 61, 67, 81 (base), 96, 110, 124, 138, 166, 194, 222 và 282. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,90 (3H, t, J=6.93 HZ), 1,26-1,34 (22H, broad), 1,56-1,67 (2H, tt, J=6,27 Hz, 6,8 Hz), 2,0 (3H, s), 4,02-4,07 (2H, t, J=6,8 Hz) và 5,31-5,44 (2H, m). Phổ 13C NMR (ppm): 13,95, 21,01, 22,12, 22,17, 25,90, 28,59, 29,12, 29,25, 29,47, 29,49, 29,52, 29,63, 31,82, 32,27, 32,60, 64,67, 130,30, 130,32 và 171,28.
Bằng con đường tổng hợp sử dụng phản ứng Wittig chọn lọc làm phản ứng chính đã thành công trong việc tổng hợp Z11-16:OH được trình bày trong Hình 4.1. Tổng hiệu suất phản ứng tính từ chất phản ứng ban đầu đạt được là 42,9%. Độ tinh khiết đồng phân của sản phẩm đạt >96% (kiểm tra bằng GC- MS). Hợp chất Z11-16:OH đã được tổng hợp bằng nối acetylen (Tamaki & Kawasaki, 1977) hoặc phản ứng Wittig (Hao et al., 1996; Zong et al., 2011). Trong khi, con đường tổng hợp cũng sử dụng phản ứng Wittig, đã sử dụng hợp chất 11-Bromo-1-undecanol là sản phẩm thương mại làm hợp chất phản ứng ban đầu và phương pháp bảo vệ nhóm chức OH với MOM ether, vì thế đã rút ngắn được con đường tổng hợp (chỉ cần 4 bước để tạo thành hợp chất Z11- 16:OH). Thêm vào đó, việc sử dụng hợp chất sodium bis(trimethylsilyl)amide làm xúc tác (tạo môi trường kiềm) cho phản ứng Wittig giúp cho sản phẩm tạo thành chỉ là đồng phân Z. Điều này làm tăng hiệu suất tổng hợp, đồng thời giảm được công đoạn tách lọc đồng phân E ra khỏi mẫu.
Hình 4.6. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11- hexadecenyl acetate (dưới)
4.2. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn của pheromone tổng hợp đối với sâu tơ 4.2.1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Kết quả tổng hợp hóa học của Pheromone giới tính ở Mục 4.1 bao gồm các hợp chất Z11-16:Ald, Z11-116:OAc và Z11-16:OH được điều chế thành mồi và dùng đánh giá hiệu quả hấp dẫn ở ngoài đồng.
Từ Bảng 4.1 cho thấy hiệu quả hấp dẫn của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ.
Số lượng thành trùng đực sâu tơ bị bắt trong tất cả các bẫy từ A-1 đến A-7 (Sóc Trăng, từ 3 - 52,8 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, từ 6,1 - 119,9 TT/bẫy/tuần) cao hơn đáng kể và khác biệt ý nghĩa với mồi bằng ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane (A-9; đối chứng âm). Kết quả này khẳng định rằng các
RT:0.00 - 57.26 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 32.73 30.88 33.04 29.48 34.03 37.93 38.87 4.00 26.52 22.83 4.836.99 14.25 20.47 44.33 46.1649.47 56.59 NL: 2.28E9 TIC MS Sample3K NN31-05- 2017
hợp chất pheromone giới tính tổng hợp có hiệu quả hấp dẫn đối với thành trùng đực sâu tơ ở điều kiện ngoài đồng.
Trong đó, chỉ có mồi gồm 3 thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
Z11-15:OH với tỷ lệ 5:5:1 (A-7) cho hiệu quả hấp dẫn thành trùng sâu tơ mạnh nhất (Sóc Trăng, 52,8 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 119,9 TT/bẫy/tuần), không khác biệt ý nghĩa thống kê với mồi là thành trùng cái chưa bắt cặp (A- 8) (Sóc Trăng, 96,2 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 194,6 TT/bẫy/tuần). Bên cạnh đó, mồi chứa 2 thành phần Z11-16:Ald và Z16-11:OAc, tỷ lệ 5:5 (A-4), cho hiệu quả bắt giữ thành trùng đực sâu tơ (Sóc Trăng, 35,7 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 73,1 TT/bẫy/tuần) thấp hơn A-8, nhưng không khác biệt ý nghĩa thống kê so với A-7 và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các mồi chỉ gồm một thành phần pheromone (A-1, A-2 và A-3). Đồng thời sự hấp dẫn của sự kết hợp khác (A-5 và A-6) cho hiệu quả hấp dẫn thấp không đáng kể so với mồi gồm chỉ gồm 1 thành phần pheromone.
Điều này chỉ ra rằng Z11-16:Ald và Z11-16:OAc là hai thành phần rất cần thiết cho sự hấp dẫn thành trùng sâu tơ, thiếu một trong hai thành phần thì mồi pheromone cho hiệu quả hấp dẫn kém, còn Z11-16:OH là thành phần bổ trợ giúp tăng cường hiệu quả hấp dẫn của mồi và ở tỷ lệ 5:5:1 cho hiệu quả hấp dẫn hiệu quả nhất.
Kết quả trên cũng cho thấy kiểu thông tin bắt cặp của quần thể sâu tơ,
P. xylostella tại vùng ĐBSCL gồm ba thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
Z11-16:OH. Trong đó, hai thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc là thành phần chính và thành phần Z11-16:OH là thành phần phụ trợ. Kết quả này tương tự so với các quần thể ở Bắc Đài Loan, New Zealand, Đài Loan (Maa et al., 1984; Suckling et al., 2002; Yang et al., 2007) nhưng khác với các dòng ở Nhật Bản, Canada, Indonesia có pheromone giới tính gồm 2 thành phần là các hợp chất Z11-16:Ald và Z11-16:OAc (Koshihara et al., 1978; Chisholm et al., 1984; Zilahi-Balogh et al., 1995). Mặt khác, hai thành phần Z11-16:Ald và
Z11-16:OAc trong pheromone giới tính của thành trùng sâu tơ được tìm thấy ở nhiều tỷ lệ khác nhau. Tại Đài Loan là tỷ lệ 1:1 đến 1:3 hay 3:7 (Chow et al., 1977; Chow & Lin, 1983), còn tại Canada là tỷ lệ 7:3 (Chisholm et al., 1983). Koshihara et al. (1978) xác định ở tỷ lệ từ 6:4 đến 2:8 đều có khả năng hấp dẫn thành trùng sâu tơ, nhưng tỷ lệ 5:5 cho hiệu quả cao nhất. Wang et al.
(2004) sử dụng hai thành phần chính ở tỷ lệ 5:5 cho hiệu quả hấp dẫn quần thể sâu tơ tại Hà Nội.
Bảng 4.1. Số lượng thành trùng sâu tơ vào bẫy trong đánh thí nghiệm giá ảnh hưởng của các thành phần pheromone giới tính trên ruộng cải bắp tại xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnhVĩnh Long, từ 17/7/2016 đến 14/8/2016 và xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng, từ 9/9/2016 đến 11/10/2016 NT Thành phần mồi (mg/tuýp) Số lượng1 (TT/bẫy/tuần) Z11-16:Ald Z11-16:OAc Z11-16:OH Vĩnh Long Sóc Trăng
A-1 0,5 0 0 6,1±3,3e 3,0±2,0d A-2 0 0,5 0 7,9±5,1e 3,3±2,4d A-3 0 0 0,5 21,8±18,3d 12,0±8,7c A-4 0,25 0,25 0 73,1±61,3bc 35,7±19,8b A-5 0,5 0 0,05 56,9±52,8c 5,8±3,5cd A-6 0 0,5 0,05 12,5±7,6de 4,0±3,7d A-7 0,25 0,25 0,05 119,9±86,8ab 52,8±19,3ab
A-8 01 TT cái chưa bắt cặp2 194,6±119,3a 96,2±48,7a
A-9 5 µl n-hexane 0,0 ± 0,0f 0,0 ± 0,0e
CV (%) 28,4 29,6
Mức ý nghĩa ** **
Ghi chú: 1Số lượng thành trùng vào bẫy được quy đổi sang log (x+1) trước khi xử lý thống kê; 2Thành trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần; Giá trị trong cột có cùng một chữ cái theo sau không khác biệt ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan; ** Khác biệt ở mức 1%
4.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Dựa vào kết quả Mục 4.2.1 tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ ở điều kiện ngoài đồng với các tỷ lệ mồi phối trộn 5:5:0,1; 5:5:1 và 5:5:10. Đối chứng là mồi ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane và 01 thành trùng cái chưa bắt cặp.
Kết quả từ Bảng 4.2 cho thấy các hàm lượng của thành phần Z11- 16:OH phối hợp với mồi pheromone (B-1, B-2 và B-3) đều cho hiệu quả hấp dẫn thành trùng đực sâu tơ (116,1; 74,8 và 31,7 TT/bẫy/tuần) cao hơn hoàn toàn so với mồi bằng ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane (B-5; đối chứng âm).
Bảng 4.2. Số lượng thành trùng vào bẫy trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính trên ruộng cải bắp, tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng, từ 20/02/2017 đến 27/03/2017 Nghiệm thức Thành phần mồi (mg/tuýp) Số lượng 1 (TT/bẫy/tuần)
Z11-16:Ald Z11-16:OAc Z11-16:OH
B-1 0,25 0,25 0,005 116,1± 61,2a B-2 0,25 0,25 0,05 74,8±46,3a B-3 0,25 0,25 0,5 31,7±12,2b B-4 01 TT cái chưa bắt cặp2 84,5 ± 39,6a B-5 5 µl n-hexane 0,0 ±0,0c CV (%) 15,9 Mức ý nghĩa **
Ghi chú: 1Số lượng thành trùng vào bẫy được quy đổi sang log (x+1) trước khi xử lý thống kê; 2Thành
trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần; Giá trị trong cột có cùng một chữ cái theo sau không khác biệt ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. ** Khác biệt ở mức 1%
Trong đó, các mồi với thành phần phối trộn ở tỷ lệ 5:5:0,1 và 5:5:1 (B- 1 và B-2)thu hút số lượng thành trùng đực sâu tơ vào bẫy cao (116,1 và 74,8 TT/bẫy/tuần) không khác biệt ý nghĩa thống kê so với mồi chứa thành trùng cái chưa bắt cặp (84,5 TT/bẫy/tuần; B-4; đốic chứng dương) và cao ý nghĩa đối với nghiệm thức B-3 (31,7 TT/bẫy/tuần).
Như vậy, tỷ lệ phối trộn giữa các thành phần trong pheromone giới tính tổng hợp của trưởng thành sâu tơ tại tỉnh Sóc Trăng nói riêng và ĐBSCL nói chung được xác định là 5:5:0,1 hoặc 5:5:1 tương ứng với ba thành phần Z11- 16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH. Kết quả này cho thấy hợp chất Z11- 16:OH với tỷ lệ 1-10% trong thành phần pheromone giới tính tổng hợp đã làm gia tăng đáng kể hiệu quả hấp dẫn đối với thành trùng sâu tơ, P.xylostella. Kết quả thí nghiệm phù hợp với Ando et al. (1979) khi xác định hợp chất Z11- 16:OH chiếm 1-10% trong hỗn hợp Z11-16:Ald và Z11-16:OAc. Trong khi quần thể sâu tơ tại Canada, Đài Loan, Hà Nội, và New Zealand đáp ứng tín hiệu bắt cặp với thành phần Z11-16:OH chỉ chiếm tỷ lệ 1% trong hỗn hợp (Chisholm, 1979; Wang et al., 2004; Suckling et al., 2002) và thành phần OH chỉ chiếm tỷ lệ 0,1% trong hỗn hợp ở Nhật, Đài Loan (Koshihara & Yamada, 1980; Lin et al., 1982; Chow et al., 1983; Maa et al., 1984).
Như vậy, kết quả thí nghiệm ngoài đồng chỉ ra rằng tỷ lệ phối trộn tối ưu của Z11-16:OH trong mồi pheromone giới tính với nồng độ 1-10% và sự
hấp dẫn của 3 thành phần này sẽ được áp dụng ở ĐBSCL thay thế thành trùng cái sâu tơ.
4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH
Kế thừa kết quả Mục 4.2.2 khảo sát hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11- 16:OH (tỷ lệ 5:5:1), đối chứng là mồi ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane và 01 thành trùng cái chưa bắt cặp.
Từ Bảng 4.3 cho thấy mồi với dãy nồng độ từ 0,01 mg/tuýp đến 1,0 mg/tuýp (từ C-1 đến C-7) đều cho hiệu quả hấp dẫn thành trùng đực sâu tơ khác biệt ý nghĩa thống kê so với mồi bằng ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane (C-9).
Trong đó, mồi ở nồng độ lần lượt 0,01; 0,05 và 0,1 mg/tuýp (C-1, C-2 và C-3) cho hiệu quả hấp dẫn thành trùng đực sâu tơ mạnh (134,2; 139,5 và 107,3 TT/bẫy/tuần) tương đương so với mồi chứa thành trùng cái chưa bắt cặp (C-8; 95,0 TT/bẫy/tuần). Trong khi, các mồi với nồng độ từ 0,5 đến 1,0 mg/tuýp (C-5, C-6 và C-7) cho hiệu quả hấp dẫn (53,8; 59,8 và 50,5 TT/bẫy/tuần) thấp hơn ý nghĩa thống kê so với mồi với nồng độ 0,01; 0,05 và 0,1 mg/tuýp (C-1, C-2 và C-3). Bên cạnh đó, mồi với nồng độ 0,3 mg/tuýp (C- 4) cho hiệu quả hấp dẫn tương đương C-3 và C-7 nhưng thấp hơn ý nghĩa so với C-1 và C-2.
Kết quả này chỉ ra rằng thành trùng đực sâu tơ cho đáp ứng mạnh với pheromone giới tính ở nồng độ thấp từ 0,01 đến 0,1 mg/tuýp hiệu quả hấp dẫn bắt đầu giảm khi nồng độ cao hơn từ 0,3 đến 1,0 mg/tuýp.
Pheromone giới tính của sâu tơ được xác định gồm hai thành phần là
Z11-16:Ald và Z11-16:OAc (Tamaki et al., 1977). Khảo sát sự hấp dẫn trên đồng ruộng đã bổ sung hợp chất Z11-16:OH như là thành phần hiệp lực (auxiliary component) (Ando et al., 1979). Hàm lượng hấp dẫn của pheromone được một số tác giả xác định rằng thành trùng sâu tơ đực chỉ bị hấp dẫn bởi hàm lượng rất nhỏ của pheromone giới tính 0,01 mg (Chow et al., 1977); 0,001-0,01 mg (Koshihara et al., 1978); 0,05 hay 0,106 mg (Wang et al., 2004). Trong khi, theo Vang (2006) thì các loài bướm có kích thước nhỏ như bướm sâu vẽ bùa Phyllocnistis citrella Stainton chỉ hấp dẫn với hàm lượng pheromone rất thấp từ 10 pg-1µg. Qua kết quả trên đã nghiên cứu cho thấy rằng nếu chọn hàm lượng 0,01- 0,1 mg/tuýp của Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
quần thể trên rau họ thập tự và cũng có thể quản lý đối tượng sâu tơ gây hại ở điều kiện ngoài đồng nhằm giảm hoặc thay thế dần thuốc trừ sâu hóa học.