2.5.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Điểm kết thúc ở mỗi phản ứng được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC). Trong đó:
- Pha tĩnh: là tấm sắc ký gồm tấm nhôm mỏng được tráng một lớp silica gel dày 0,25 mm (Merck, Đức).
- Pha động: là hỗn hợp của các dung môi gồm benzen, n-hexan hoặc ethyl acetate với tỷ lệ phối trộn khác nhau. Hỗn hợp dung môi được đựng trong một lọ thủy tinh trong suốt có nắp đậy với lượng không cao hơn 1,5 cm tính từ đáy lọ.
Tấm sắc ký được cắt thành từng miếng với kích thước 2 cm x 10 cm. Dùng bút chì kẻ một đường ngang cách một đầu của giấy sắc ký khoảng 1,5 cm rồi đánh dấu điểm chấm mẫu lên đường kẻ. Dùng Pasteur pippette chấm mẫu lên điểm dánh dấu, sau đó đặt giấy sắc ký vào lọ dung môi. Quan sát sự di chuyển của dung môi trên giấy, khi dung môi cách đỉnh của giấy sắc ký 1,5 – 2 cm thì lấy giấy sắc ký ra khỏi lọ, dùng bút chì vạch một đường ngang để đánh dấu mực di chuyển dung môi (Hình 3.5). Sau khi bay hơi hết dung môi trên giấy sắc ký, mẫu được làm hiện bằng cách phun dung dịch Potassium permanganate (KMnO4) (đối với mẫu có chứa nối đôi trong phân tử) lên bề mặt giấy sắc ký, hoặc phun dung dịch H2SO4 20% sau đó hơ nóng (mẫu không có chứa nối đôi trong phân tử).
Phản ứng chỉ kết thúc khi trong mẫu không còn sự hiện diện của chất phản ứng ban đầu (không có đốm hiện diện của chất phản ứng ban đầu trên đường di chuyển theo dung môi của mẫu
2.5.3. Thẩm định cấu trúc hóa học của mẫu tổng hợp
Mẫu tổng hợp ở mỗi giai đoạn của quy trình sau khi tinh lọc sẽ được thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật Sắc ký khí - Khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrometry, GC - MS) và phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (Infrared - IR) (tại khoa Khoa học, trường Đại học Cần Thơ). Đồng thời, mẫu cũng được gởi đến Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo để phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ khối lượng của mẫu tổng hợp được ghi nhận bằng máy liên hợp sắc ký (GC) – Khối phổ (MS) với GC-MS là Thermo Scientific Trace Ultra (Hình 3.11). Cột sắc ký được dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-5 (0,25 mm ID x 30 m; Agilent Technologies). Sự ion hóa được thực hiện theo kiểu va chạm ion (Electron Impact, EI mode) ở điện thế 70 eV và nhiệt độ 2300C. Phổ khối lượng được đặt trong khoảng m/z từ 40-500. Cột sắc ký được dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-23 (capillary column, 0.25 mm ID x 30 m; J&W Scientific) với chương trình nhiệt độ: 800C (trong 2 phút), tăng lên 2100C ở tốc độ 80C/phút và giữ ở 2100C trong 15 phút.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo bằng máy Jeol Alpha 300 Fourier transform spectrometer (Nihondenshi, Tokyo, Japan) ở tần số 300,4 MHz (cho phổ 1H) and 75,45 MHz (cho phổ 13C). Dung môi dùng để pha loãng mẫu là deuterium chloroform (CDCl3) và chất nội chuẩn (internal standard) là Tetramethylsilane (TMS).
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian, địa điểm và phương tiện tiến hành thí nghiệm 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Thời gian tiến hành luận án được thực hiện từ năm 2015 đến 2019.
3.1.2. Địa điểm
- Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại:
+ Phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông Nghiệp trường Đại học Cần Thơ – Thực hiện các bước trong quy trình tổng hợp, điều chế mồi và nhân nuôi nguồn thành trùng sâu tơ.
+ Phòng thí nghiệm, Bộ môn Hóa, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ – Thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ và phân tích phổ hồng ngoại.
+ Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo – Gởi mẫu phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân.
- Các thí nghiệm ngoài đồng được tiến hành trên các ruộng trồng rau cải của hộ nông dân tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng; xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long và Phường 6, Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
3.1.3. Vật liệu 3.1.3.1. Thiết bị 3.1.3.1. Thiết bị
Tủ sấy; Hệ thống máy cô quay (Rotary evaporator RE300; waterbath RE300B; JSR Ref. bath); Máy khuấy từ gia nhiệt; Máy Sắc ký - Khối phổ (Gas chromatography–Mass spectrometry); Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectrometry); Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance); Tủ lạnh;
Lọ thủy tinh màu nâu có nắp đậy (thể tích 4 ml); Micro syringe (dung tích 100 μl, 25 μl); Paster pipett; Bình cầu thủy tinh; Phiễu ly trích; Cột sắt ký mở; Bình tam giác; Beaker thủy tinh.
3.1.3.2. Dụng cụ
Tấm sắc ký (Chromatography paper) lớp mỏng 0,25mm silica gel (silica gel plate) (Merk, Đức);
Hộp nhựa tròn (đường kính 10 cm, chiều cao 8 cm); Hộp plastic (đường kính 4 cm, chiều cao 3,5 cm) có nắp đậy;
Rổ lọc trà bằng lưới inox hình bán cầu (đường kính 6cm, cao 3cm) và một số vật liệu hỗ trợ cần thiết khác như máy ảnh, cân điện tử, giấy nhôm, tập, viết, thước, dây ni lông;
Bẫy hấp dẫn là dạng bẫy dính có mái che (30 x 27 cm, Takeda Chemical Ind. Ltd.Osaka, Nhật Bản) và tuýp cao su non (đường kính 0,3 cm, dài 1,5 cm, dùng để ghép cây cà chua non).
3.1.3.3. Hóa chất
a. Hóa chất dùng trong phản ứng
11-Bromo-1-undecanol [Br(CH2)11OH]; Pyridinium chlorochromate [PCC, C5H5NH(CrO3Cl)]; Pentanal (C5H10O); Dimethoxymethane (DMM, C3H8O2); Lithium bromide (LiBr); p-tolunenesulfonic acid monohydrate (p- TsOH, CH3C6H4SO3H.H2O); Triphenylphosphine (PPh3, C18H15P); Sodiumsulfate (Na2SO4); n-butyl Lithium (n-BuLi, solution 1.6M in n-hexane) và silica gel.
b. Dung môi
Benzen (C6H6); n-hexane (C6H14); Ethyl acetate (C4H8O2); Tetrahydrofuran (THF, (CH2)4O); Methylene chloride (CH2Cl2); Axit clohydric (HCl);Natri bicarbonat (NaHCO3) và Pyridine (C5H5N).
c. Mồi pheromone giới tính và kairomone Mồi pheromone giới tính tổng hợp
Các thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH được tổng hợp bởi Chi & Vang (2018) tại phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ.
Mồi kairomone
Hợp chất bay hơi Allyl isothiocyanate (AITC) và cis -3-hexenyl acetate (Z3-
A B C