Theo nghiên cứu của Dai et al. (2008) thành trùng đực và cái sâu tơ cho khả năng đáp ứng điện râu (Electroantennogram-EAG) với 13 hợp chất bay hơi từ cải. Trong đó bezaldehyde, phenylacetaldehyde, allyl isothiocyanate, cis-3-hexen-1-ol (Z3-6:OH) và cis-3-hexenyl acetate (Z3-6:OAc) cho đáp ứng mạnh hơn so với các hợp chất monoterpenic.
Wang et al. (2005) đã kiểm tra phản ứng điện râu đầu (EAG) của P. xylostella, chất bay hơi ở thực vật, cis-3-hexen-1-ol (OH), cis-3-hexenyl acetate và allyl isothiocyanate, trong phòng thí nghiệm. Những thành trùng đực hoặc cái tỏ ra đáp ứng mạnh hơn với các chất dễ bay hơi ở nồng độ cao hơn (0.008, 0,08, 0,2, 0,8, 8, 20 và 40 μg/μl). Trong đó, cis-3-hexenyl acetate và allyl isothiocyanate có đáp ứng mạnh hơn.
Thành trùng đực và cái sâu tơ chưa bắt cặp cho đáp ứng mạnh với 1- hexanol và cis-3-hexen-1-ol (Z3-6:OH) và đáp ứng thấp hơn với cis-3-hexenyl acetate (Z3-6:OAc) trong phòng thí nghiệm (Li et al., 2012).
2.4.3. Hiệu quả hấp dẫn của kairomone kết hợp với pheromone giới tính đối với sâu tơ
Theo Reddy & Guerrero (2000) cải tiến các mồi hấp dẫn cụ thể bằng cách bổ sung một lượng nhỏ các thành phần phụ khác pheromone có thể hữu ích, nhưng nó cũng sẽ tăng chi phí của nhà sản xuất. Việc sử dụng rẻ tiền GLVs (từ 0,1 đến 5% chi phí của một loại thông thường thành phần pheromone) có thể tăng hiệu quả của pheromone và giảm lượng pheromone cần thiết.
Hỗn hợp pheromone giới tính sâu tơ với (Z) -3-hexenyl axetat hiệu quả trong hấp dẫn cả thành trùng đực và cái, được đề nghị trong các nghiên cứu kiểm soát dịch hại trong tương lai
2000).
Các chất bay hơi từ lá (GLVs) từ cải bắp (Brassica oleracea) và pheromone (hỗn hợp của Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH) tạo ra sự hấp dẫn cao hơn đáng kể đối với thành trùng đực sâu tơ chưa bắt cặp so với pheromone đơn lẻ. (Reddy & Guerrero, 2004).
Trong phòng thí nghiệm (thông qua buồng gió – wind tunnel), hỗn hợp của Z3-6:OAc, (Z)-2-hexenol và Z3-6:OH với pheromone hấp dẫn được 80- 100% thành trùng đực chưa bắt cặp, cho hiệu quả cao hơn đáng kể so với pheromone đơn lẻ. GLVs kết hợp với pheromone đều thu hút rất thấp thành trùng đực đã bắt cặp và thành trùng cái chưa bắt cặp; trong khi đó thành trùng cái đã bắt cặp, các hợp chất này đã hấp dẫn được khoảng 60% số lượng thành trùng thử nghiệm (Reddy & Guerrero, 2000).
Dai et al. (2008) ghi nhận pheromone kết hợp với Z3-6:OAc và pheromone kết hợp với Z3-6:OH, Z3-6:OAc, allyl isothiocyanate làm tăng khả năng thu hút thành trùng đực lên đến 46,4 và 75%, tương ứng so với pheromone đơn lẻ. Vì vậy, Dai et al. đã đề nghị sử dụng bẫy với mồi là phối trộn của pheromone kết hợp với Z3-6:OH, Z3-6:OAc và allyl isothiocyanate như công cụ để quản lý loài sâu tơ gây hại.
Ở các thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện trong năm 2008 và 2009, thành trùng sâu tơ đã được thu thập đáng kể bằng bẫy pheromone giới tính tổng hợp với một hoặc hai cis-3-hexenyl acetate đơn lẻ hoặc hỗn hợp cis-3- hexenyl acetate, cis-3-hexen-1-ol, và (E)-2-hexenal so với pheromone giới tính. Những kết quả này chứng minh rằng các chất bay hơi từ lá (GLVs) có thể được sử dụng để tăng cường thu hút các con đực P. xylostella đến bẫy bắt cặp pheromone giới tính (Li et al., 2012).
2.5. Các phản ứng cơ bản trong tổng hợp
2.5.1. Các phản ứng cơ bản trong hóa học hữu cơ
2.5.1.1. Phản ứng bảo vệ nhóm chức (nhóm hydroxyl – OH)
Đây là phương pháp chuyển hóa tạm thời nhóm chức cần bảo vệ thành nhóm chức khác mà nhóm này sẽ không bị biến đổi trong suốt quá trình chuyển hóa của nhóm chức cần thiết (Thảo, 2005).
Hình 2.4. Sơ đồ bảo vệ nhóm hydroxyl (-OH) bằng (A) nhóm MOMvà (B) nhóm THP và (B) nhóm THP
Nhóm hydoxyl thông thường được bảo vệ bằng cách chuyển thành alkyl hoặc silyl ether sử dụng các nhóm bảo vệ như tetrahydropyranyl (THP), methoxymethyl (MOM), β-methoxymethyl, methylthiomethyl (MTM), benzyl, t-Butyldimethylsilyl (TBDMS) (Green & Wuts, 1999).
2.5.1.2. Phản ứng tách nhóm bảo vệ
Đây là phản ứng mà nhóm bảo vệ của nhóm chức được tách ra để chuyển hóa lại nhóm chức ban đầu. Thông thường, các nhóm bảo vệ ether được tách bằng cách thủy giải trong môi trường acid yếu và nhóm este được thủy giải trong môi trường kiềm (Thảo, 2005).
2.5.1.3. Phản ứng oxy hóa alcol bậc 1
Phản ứng gồm 2 quá trình: dehydro hóa tạo aldehyde từ rượu và aldehyde bị oxy hóa tiếp theo tạo cacboxylic trong dung môi pyridine sử dụng tác nhân oxy hóa là Cr(VI) trong pyridin (như pyridinicloromat hay pyridinibicromate) hoặc dimetylsunfoxit (DMSO) trong pyridin hoặc sunfotrioxit pyridine trong anhydric acetic (Thảo, 2005).
Hình 2.5. Sơ đồ quá trình oxy hóa alcol bậc 1
2.5.1.4. Phản ứng ankyl helogenua
đổi một rượu một ankyl halogenua liên quan đến việc điều chế rượu với HX (X: Cl, Br hoặc I).
Hình 2.6. Sơ đồ phản ứng ankyl halogenua
2.5.1.5. Phản ứng oxy hóa
Phản ứng oxy hóa là phản ứng tạo ra andehyde từ rượu trong môi trường Methyl chloride với chất oxy hóa thường được sử dụng trong phản ứng này là Pyridinium chlorochromate (PCC) hoặc Dimethylsulfoxide (DMSO) (được gọi phản ứng Swern) phản ứng xảy ra như sau:
Hình 2.7. Sơ đồ phản ứng oxy hóa
2.5.1.6. Phản ứng acetyl hóa
Phản ứng acetyl hóa là phản ứng tạo este từ rượu và acid chloride (R- CO-Cl) hoặc anhydride (RCOO-COR’) trong môi trường bazơ như trimethylamine hoặc pyridine (Shirini et al., 2003).
Hình 2.8. Sơ đồ phản ứng acetyl hóa
2.5.1.7. Phản ứng Wittig
Phản ứng Wittig là phương pháp tổng hợp alken từ aldehyde hoặc ketone với một triphenyl phosphonium ylide (thường gọi là tác nhân Wittig) dưới tác động bazơ (base) của n-BuLi để tạo thành alkene và triphenylphosphine oxide. Với ưu điểm dễ thực hiện, điều kiện phản ứng đơn giản và tạo đồng thời cùng lúc 2 sản phẩm gồm đồng phân cis (Z-) và trans (E-) với tỷ lệ 3:1. Phản ứng này được khám phá bởi nhà hóa học người Đức Georg Wittig, phản ứng này đã đem lại cho ông giải thưởng Nobel Hóa học năm 1979.
Hình 2.9. Sơ đồ phản ứng Wittig
2.5.1.8. Phản ứng ester hóa
Phản ứng ester hóa là phản ứng tạo ra este (R1-COO-R2). Khi kết hợp Acide hữu cơ (R1-COOH) và rượu (R2-OH) trong môi trường acide (H+).
Hình 2.10. Sơ đồ phản ứng ester hóa
2.5.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Điểm kết thúc ở mỗi phản ứng được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC). Trong đó:
- Pha tĩnh: là tấm sắc ký gồm tấm nhôm mỏng được tráng một lớp silica gel dày 0,25 mm (Merck, Đức).
- Pha động: là hỗn hợp của các dung môi gồm benzen, n-hexan hoặc ethyl acetate với tỷ lệ phối trộn khác nhau. Hỗn hợp dung môi được đựng trong một lọ thủy tinh trong suốt có nắp đậy với lượng không cao hơn 1,5 cm tính từ đáy lọ.
Tấm sắc ký được cắt thành từng miếng với kích thước 2 cm x 10 cm. Dùng bút chì kẻ một đường ngang cách một đầu của giấy sắc ký khoảng 1,5 cm rồi đánh dấu điểm chấm mẫu lên đường kẻ. Dùng Pasteur pippette chấm mẫu lên điểm dánh dấu, sau đó đặt giấy sắc ký vào lọ dung môi. Quan sát sự di chuyển của dung môi trên giấy, khi dung môi cách đỉnh của giấy sắc ký 1,5 – 2 cm thì lấy giấy sắc ký ra khỏi lọ, dùng bút chì vạch một đường ngang để đánh dấu mực di chuyển dung môi (Hình 3.5). Sau khi bay hơi hết dung môi trên giấy sắc ký, mẫu được làm hiện bằng cách phun dung dịch Potassium permanganate (KMnO4) (đối với mẫu có chứa nối đôi trong phân tử) lên bề mặt giấy sắc ký, hoặc phun dung dịch H2SO4 20% sau đó hơ nóng (mẫu không có chứa nối đôi trong phân tử).
Phản ứng chỉ kết thúc khi trong mẫu không còn sự hiện diện của chất phản ứng ban đầu (không có đốm hiện diện của chất phản ứng ban đầu trên đường di chuyển theo dung môi của mẫu
2.5.3. Thẩm định cấu trúc hóa học của mẫu tổng hợp
Mẫu tổng hợp ở mỗi giai đoạn của quy trình sau khi tinh lọc sẽ được thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật Sắc ký khí - Khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrometry, GC - MS) và phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (Infrared - IR) (tại khoa Khoa học, trường Đại học Cần Thơ). Đồng thời, mẫu cũng được gởi đến Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo để phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ khối lượng của mẫu tổng hợp được ghi nhận bằng máy liên hợp sắc ký (GC) – Khối phổ (MS) với GC-MS là Thermo Scientific Trace Ultra (Hình 3.11). Cột sắc ký được dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-5 (0,25 mm ID x 30 m; Agilent Technologies). Sự ion hóa được thực hiện theo kiểu va chạm ion (Electron Impact, EI mode) ở điện thế 70 eV và nhiệt độ 2300C. Phổ khối lượng được đặt trong khoảng m/z từ 40-500. Cột sắc ký được dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-23 (capillary column, 0.25 mm ID x 30 m; J&W Scientific) với chương trình nhiệt độ: 800C (trong 2 phút), tăng lên 2100C ở tốc độ 80C/phút và giữ ở 2100C trong 15 phút.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo bằng máy Jeol Alpha 300 Fourier transform spectrometer (Nihondenshi, Tokyo, Japan) ở tần số 300,4 MHz (cho phổ 1H) and 75,45 MHz (cho phổ 13C). Dung môi dùng để pha loãng mẫu là deuterium chloroform (CDCl3) và chất nội chuẩn (internal standard) là Tetramethylsilane (TMS).
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian, địa điểm và phương tiện tiến hành thí nghiệm
3.1.1. Thời gian
Thời gian tiến hành luận án được thực hiện từ năm 2015 đến 2019.
3.1.2. Địa điểm
- Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại:
+ Phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông Nghiệp trường Đại học Cần Thơ – Thực hiện các bước trong quy trình tổng hợp, điều chế mồi và nhân nuôi nguồn thành trùng sâu tơ.
+ Phòng thí nghiệm, Bộ môn Hóa, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ – Thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ và phân tích phổ hồng ngoại.
+ Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo – Gởi mẫu phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân.
- Các thí nghiệm ngoài đồng được tiến hành trên các ruộng trồng rau cải của hộ nông dân tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng; xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long và Phường 6, Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
3.1.3. Vật liệu3.1.3.1. Thiết bị 3.1.3.1. Thiết bị
Tủ sấy; Hệ thống máy cô quay (Rotary evaporator RE300; waterbath RE300B; JSR Ref. bath); Máy khuấy từ gia nhiệt; Máy Sắc ký - Khối phổ (Gas chromatography–Mass spectrometry); Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectrometry); Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance); Tủ lạnh;
Lọ thủy tinh màu nâu có nắp đậy (thể tích 4 ml); Micro syringe (dung tích 100 μl, 25 μl); Paster pipett; Bình cầu thủy tinh; Phiễu ly trích; Cột sắt ký mở; Bình tam giác; Beaker thủy tinh.
3.1.3.2. Dụng cụ
Tấm sắc ký (Chromatography paper) lớp mỏng 0,25mm silica gel (silica gel plate) (Merk, Đức);
Hộp nhựa tròn (đường kính 10 cm, chiều cao 8 cm); Hộp plastic (đường kính 4 cm, chiều cao 3,5 cm) có nắp đậy;
Rổ lọc trà bằng lưới inox hình bán cầu (đường kính 6cm, cao 3cm) và một số vật liệu hỗ trợ cần thiết khác như máy ảnh, cân điện tử, giấy nhôm, tập, viết, thước, dây ni lông;
Bẫy hấp dẫn là dạng bẫy dính có mái che (30 x 27 cm, Takeda Chemical Ind. Ltd.Osaka, Nhật Bản) và tuýp cao su non (đường kính 0,3 cm, dài 1,5 cm, dùng để ghép cây cà chua non).
A B C
Hình 3.1. Bẫy hấp dẫn: (A) máy che; (B) tấm dính; (C) tuýp cao su
3.1.3.3. Hóa chất
a. Hóa chất dùng trong phản ứng
11-Bromo-1-undecanol [Br(CH2)11OH]; Pyridinium chlorochromate [PCC, C5H5NH(CrO3Cl)]; Pentanal (C5H10O); Dimethoxymethane (DMM, C3H8O2); Lithium bromide (LiBr); p-tolunenesulfonic acid monohydrate (p- TsOH, CH3C6H4SO3H.H2O); Triphenylphosphine (PPh3, C18H15P); Sodiumsulfate (Na2SO4); n-butyl Lithium (n-BuLi, solution 1.6M in n-hexane) và silica gel.
b. Dung môi
Benzen (C6H6); n-hexane (C6H14); Ethyl acetate (C4H8O2); Tetrahydrofuran (THF, (CH2)4O); Methylene chloride (CH2Cl2); Axit clohydric (HCl); Natri bicarbonat (NaHCO3) và Pyridine (C5H5N).
c. Mồi pheromone giới tính và kairomone Mồi pheromone giới tính tổng hợp
Các thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH được tổng hợp bởi Chi & Vang (2018) tại phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ.
Mồi kairomone
Hợp chất bay hơi Allyl isothiocyanate (AITC) và cis -3-hexenyl acetate (Z3- 6:OAc) là sản phẩm được mua từ Công ty Aldrich (Mỹ) với độ tinh khiết trên 99%.
3.1.3.4. Nguồn thành trùng sâu tơ
Ấu trùng sâu tơ được thu thập từ các ruộng trồng rau cải họ thập tự (huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng và huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long) rồi chuyển về phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ.
Trong phòng thí nghiệm, ấu trùng sâu tơ được nuôi trong hộp nhựa có kích thước 12 cm x 10 cm x 7 cm, được cung cấp lá cải xanh tươi làm nguồn thức ăn đến khi sâu hóa nhộng. Mỗi nhộng được tách ra nuôi riêng trong từng hộp nhựa nhỏ (4 cm x 2,5 cm x 3,5 cm) bên trong có đặt miếng bông gòn ướt để tạo ẩm. Thành trùng sau khi vũ hóa được phân biệt đực, cái (Huỳnh & Sen, 2003) và nuôi thành trùng bằng dung dịch đường sucrose 10% (Vang et al.,2006; Li et al., 2012; Dai et al., 2008)
♀
♂
A B C D E
Hình 3.2 Quy trình thu thập và nhân nuôi thành trùng sâu tơ
(A) Sâu; (B) Hộp nhựa nuôi sâu; (C) Nhộng; (D) Hộp plastic để nuôi riêng nhộng và thành trùng; (E) thành trùng cái và đực
3.1.3.5. Điều chế mồi
a. Mồi là thành phần hóa học
Các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald, Z11-16:OAc, AITC và Z3- 6:OAc được pha loãng trong n-hexane tinh khiết ở hàm lượng 10mg/ml. Dùng microsyringe hút lấy một lượng tương ứng bơm nhẹ lên thành bên trong của tuýp cao su non. Sau đó để yên 10 phút (cho dung môi bay hơi), tuýp cao su được gói lại bằng giấy nhôm, dán nhãn và trữ trong ngăn mát của tủ lạnh cho đến khi tiến hành thí nghiệm ngoài đồng (Hình 3.3).
Hình 3.3. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng pheromone giới tính và cáchợp chất hữu cơ bay hơi hợp chất hữu cơ bay hơi
b. Mồi là thành trùng
Thành trùng sâu tơ cái vũ hóa một ngày (chưa bắt cặp) được thả vào bên trong rổ lượt trà bằng lưới inox bên trong có treo một miếng bông gòn tẩm nước đường 10%. Rổ được đậy bằng một tấm bìa cứng và đặt vào giữa tấm dính của bẫy với phần mặt cầu của rỗ hướng lên trên (Hình 3.4.) Mồi chỉ được chuẩn bị vào buổi chiều ở thời điểm ngay trước khi treo bẫy trên ruộng thí nghiệm. Thành trùng trong bẫy và miếng bông gòn tẩm nước đường 10%, thành trùng trong bẫy được thay mới 3 - 4 ngày/lần vào lúc chiều mát (Reddy & Urs, 1997).
Hình 3.4. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng thành trùng cái
c. Mồi là dịch nghiền cải
Lá cải bắp trưởng thành được rửa sạch, để ráo nước, cắt nhỏ, trộn đều. Trên ruộng thí nghiệm 50 g lá cải được cho vào cối sứ giả nhuyễn cùng với 5 ml n-hexane. Dùng ống nhỏ giọt hút 1,0 ml dịch lá cải nghiền cho vào mỗi miếng bông gòn được đặt trên miếng bìa cứng (1,5 cm x 2 cm) ở giữa tấm dính của bẫy (Hình 3.5). Mồi được thay mới 3 – 4 ngày/lần, cùng thời điểm với việc thay mới thành trùng cái trong bẫy (Đém & Vàng, 2014).
Hình 3.5. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng dung dịch lá cải bắp
3.1.3.6. Đặt bẫy hấp dẫn trên ruộng thí nghiệm
Trên ruộng thí nghiệm, mồi được đặt lên giữa tấm dính và lồng vào mái che của bẫy. Dùng 2 thanh tre dài cắm chéo nhau trên mặt ruộng để treo bẫy ở độ cao cách mặt ruộng khoảng 0,5 m (Miluch et al., 2014) (Hình 3.6). Bẫy được đặt trên ruộng ở mật độ 12 bẫy/1.000 m2 (tương ứng khoảng 1 bẫy/80 m2) (Reddy & Urs, 1997).
Hình 3.6. Bẫy hấp dẫn được treo trên cải bắp thí nghiệm. Độ cao của bẫy (A);Khoảng cách giữa các bẫy (B) Khoảng cách giữa các bẫy (B)
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đề tài ứng dụng hóa chất tín hiệu nhằm góp phần thay thế thuốc bảo vệ thực vật để quản lý sâu tơ P. xylostella hại rau cải ở điều kiện ngoài đồng.
Tổng hợp pheromone giới tính sâu tơ
1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp
2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn
3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn
Kairomone
(thương mại)
AITC Z3-6:OAc
Đánh giá hiệu Đánh giá hiệu quả của hợp chất quả của hợp chất
(AITC) (Z3-6:OAc)
Đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone giới tính và kairomone đối với sâu tơ
1. Khảo sát thời gian hoạt động của thành trùng sâu tơ
2. Khảo sát sự biến động mật số quần thể sâu tơ trong năm
3. Khảo sát sự biến động mật số quần thể và tỷ lệ rau cải bị hại do sâu tơ trong một vụ cải
Đánh giá hiệu quả của biện pháp đặt bẫy hấp dẫn đối với sâu tơ