4. Nội dung nghiên cứu
3.1.Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus
3.1.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm
Tỷ lệ tiếp giống là yếu tố ảnh hưởng chất lượng của quá trình sản xuất chế phẩm. Để đánh giá được ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến chất lượng chế phẩm sinh học từ chủng Rhodobacter capsulatus tiến hành tạo thí nghiệm trong các bình tam giác 2l chứa 1l môi trường DSMZ -27 với tỷ lệ giống lần lượt bổ sung: 2%, 5%, 10% và 15%. Tiến hành nuôi tĩnh ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC trong thời gian 5 ngày. Xác định sự sinh trưởng của chủng Rhodobacter capsulatus (CFU/ml) sau mỗi ngày, kết quả thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Mật độ vi khuẩn Rhodobacter capsulatus trong các công thức tiếp giống khác nhau.
Tỉ lệ giống
Mật độ VK (109 CFU/ml) sau số ngày
1 2 3 4 5
2% 8.61a 8,92±0.01 a 9.45±0.02 a 9.47±0.04 a 9.61±0.05 a
5% 9.02b 9.64±0.01 b 9.82±0.01 b 9.88±0.02 b 9.89±0.01 b
10% 9.71c 10.34±0.01 c 10.53±0.03c 10.79±0.01c 11.04±0.05c
15% 10.27±0.01c 10.82c 11.33±0.06c 11.33±0.03c 11.24±0.15c
Chú thích: kí hiệu a,b,c biểu diễn sự sai khác có ý nghĩa ở mức (p<0,05) theo cột, giá trị bằng giá trị trung bình±SD (n=3)
Từ kết quả ở bảng 3.1, xây dựng được đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến mật độ của chủng Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm sau 5 ngày.
23
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến mật độ của chủng Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm.
Kết quả của bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, với các tỷ lệ tiếp giống khác nhau thì mật độ VSV trong chế phẩm lỏng từ chủng chủng Rhodobacter capsulatus có sự khác nhau. Khi tăng tỷ lệ tiếp giống từ 2% đến 5% nhận thấy chênh lệch không đáng kể của mật độ VSV trong chế phẩm tuy nhiên khi tăng tỷ lệ giống lên 10% thì nhận thấy có sự chênh lệch khá rõ rệt. Với tỷ lệ tiếp giống 10%, sau 5 ngày mật độ chủng chủng Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm đạt 1,1.109 CFU/mL. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng tỷ lệ tiếp giống lên 15% nhận thấy, sau 5 ngày mật độ VSV trong chế phẩm có xu hướng giảm. Điều này được lý giải như sau: khi tỷ lệ giống tiếp quá cao thì chất dinh dưỡng trong môi trường nhanh chóng cạn kiệt dẫn đến mật độ VSV giảm (Nguyễn Lân Dũng et al., 2001). Với mục đích tạo ra một chế phẩm có tỷ lệ VSV cao đáp ứng yêu cầu về chất lượng chế phẩm VSV lỏng của TCVN 7304-2:2003 thì chúng tôi chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp là 10%. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của khảo sát của Đỗ Thị Liên và cộng sự năm 2015 nhận thấy với chế phẩm lỏng từ các chủng Rhodobacter spp. Với tỷ lệ 10% cho thấy hiệu suất xử lý nước thải đạt cao nhất (Đỗ Thị Liên, 2016). Tuy nhiên so với một số chế phẩm từ các chủng VSV khác thì kết quả này có sự sai khác. Trong nghiên cứu của Phương Thị Hương và cộng sự năm 2018, tỷ lệ tiếp giống 7% là thích hợp để lên men Bacillus subtilis
ứng dụng sản xuất chế phẩm (Hương & Hạnh, 2018). Trong một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Hằng Nga và cộng sự (Nguyễn Thị Hằng Nga et al., 2016) tỷ lệ tiếp giống là 3% để lên men 3 Streptomyces griseorubens, Azotobacter beijerinckii, Bacillus polyfermenticus để đạt được mật độ ở cả 3 chủng ≥109 CFU/ml.
8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 1 2 3 4 5 M ật đ ộ tế b ào (C F U/m l)
Thời gian (Ngày)
24
3.1.2. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm
Với mục đích chọn lựa nguồn cơ chất thích hợp, dễ tìm kiếm, sử dụng thuận tiện và giảm giá thành cho sản xuất sinh khối. Rỉ đường là nguồn cơ chất thường được sử dụng để thay thế nguồn carbon trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bởi thành phần chủ yếu của rỉ đường là các loại glucid hòa tan (sucrose là chủ yếu), ngoài ra rỉ đường là một nguồn giàu khoáng và các sắc tố vitamin (Binkley & Wolform, 1953). Thành phần bột đậu nành chủ yếu là protein, carbohydrate, đường, cùng các loại khoáng chất và vitamin vì vậy có thể thay thế một số nguồn cơ chất trong môi trường dinh dưỡng để vi sinh vật phát triển.
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng tích lũy sinh khối của chủng Rhodobacter capsulatus trong môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung bột đậu nành (CT1), rỉ đường (CT2) với hàm lượng 2 g/l và chỉ sử dụng môi trường DSMZ27 cải tiến (CT3). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên. Kết quả xác định mức độ tích lũy sinh khối ở OD660 được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Mật độ VSV trong các công thức chế phẩm khác nhau. Công thức Mật độ VSV (109 CFU/ml) sau số ngày
1 2 3 4 5 CT1 (Đậu nành) 9.62 9.70±0.02 a 9.8±0.01a 10.14±0.14a 10.54±0.06a CT2 (Rỉ đường) 9.62 9.66±0.01 a 9.84±0.01a 9.97±0.02a 10.09±0.04a CT3 (Không bổ sung) 9.62 9.63±0.01b 9.66±0.03b 9.72±0.03b 9.80±0.01b
Chú thích: kí hiệu a,b biểu diễn sự sai khác có ý nghĩa ở mức (p<0,05) theo cột, giá trị bằng giá trị trung bình±SD (n=3)
25
Hình 3.2. Mật độ VSV trong các công thức chế phẩm khác nhau.
Hình 3.3. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn Rhodobacter capsulatus trên các nguồn cơ chất thay thế (p=value<0.05).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.2, hình 3.2 và hình 3.3 cho thấy, chủng Rhodobacter capsulatus có khả năng sinh trưởng trên cả ba nguồn cơ chất là rỉ đường, bột đậu nành và đối chứng (MT DSMZ27 cải tiến), tuy nhiên với nguồn cơ chất là bột đậu nành nhận thấy mất độ tế bào vi khuẩn là cao nhất, đạt 1,054.109 CFU/ml. Theo hình 3.3 so sánh tốc độ sinh trưởng của chủng Rhodobacter capsulatus sau 5 ngày trên các nguồn cơ chất thay thế cho kết quả tốc độ sinh trưởng của chủng vi khuẩn trên nguồn cơ là có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong nghiên cứu cho thấy, tốc độ sinh trưởng của công thức môi trường DSMZ- 27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành cao hơn khi bổ sung công thức bổ sung 2 (g/l) rỉ đường và môi trường không bổ sung thêm cơ chất gì. Bột đậu nành là cơ chất giàuprotein và các khoáng chất, thích hợp cho chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus sinh trưởng và phát triển. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của khảo sát của Đỗ Thị Liên và
9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 1 2 3 4 5 Mật độ tế bào (CFU/m l)
Thời gian (Ngày) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
26
cộng sự năm 2015 nhận thấy với chế phẩm lỏng từ các chủng Rhodobacter spp. trên nguồn cơ chất bột đậu nành cho thấy chất lượng chế phẩm đạt tốt nhất (Đỗ Thị Liên, 2015).
Do vậy có thể sử dụng nguồn cơ chất là đậu nành cho nuôi cấy sản xuất sinh khối trên quy mô lớn do dễ tìm kiếm và giá thành rẻ nên chúng tôi lựa chọn bột đậu nành để sản xuất sinh khối Rhodobacter capsulatus ở quy mô lớn.
3.1.3. Quy trình công nghệ tạo chế phẩm lỏng từ chủng Rhodobacter capsulatus
Quy trình công nghệ tạo chế phẩm lỏng từ chủng Rhodobacter capsulatus được thể hiện ở sơ đồ sau:
Hình 3.4. Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh lỏng
27
Hình 3.5. Quy trình nhân giống chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus.
Hoạt hóa giống
Chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus đã được phân lập và giữ giống trong ống effendol bằng glyxerol trong tủ lạnh âm sâu ở -4oC. Tiến hành hoạt hóa trên môi trường đặc trưng DSMZ 27 có bổ sung 2% agar bằng phương pháp cấy ria từ ống giống được bảo quản bằng glyxerol. Sau đó tiến tục nhân nhanh sinh khối bằng các lấy khuẩn lạc đơn trên đĩa đã ria cho vào 50ml môi trường DSMZ27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành lỏng trong bình tam giác 250ml đã được khử trùng ở điều kiện 121oC, 1 atm trong thời gian 20 phút, tiến hành nuôi trong điều kiện ánh sáng tự nhiên ở nhiệt độ 30-32oC. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660) (Myers et al., 2013). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ Jascop V-750.
Nhân giống cấp 1
Từ chủng vi khuẩn đã hoạt hóa bắt đầu tiến hành nhân giống cấp 1 sử dụng 200ml môi trường DSMZ -27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành được chuẩn bị trong các bình thủy tinh có dung tích 250ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, trong vòng 21 phút. Để nguội môi trường trong tủ cấy và tiến hành tiếp giống 10% chủng
Rhodobacter capsulatus. Nuôi dưới ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC sau 48 – 60h khi vi sinh vật đang ở pha sinh trưởng mật độ đạt 109 CFU/ml tiến hành cấy chuyển nhân giống
28
cấp 2. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ.
Nhân giống cấp 2
Sau khi nhân giống cấp 1 trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC sau 48 – 60h khi vi sinh vật đang ở pha sinh trưởng mật độ đạt 109 CFU/ml tiến hành cấy chuyển nhân giống cấp 2 sử dụng 400ml môi trường DSMZ -27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành được chuẩn bị trong các bình thủy tinh có thể tích 500ml hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, trong vòng 21 phút.Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ.
Lên men sinh khối vi sinh vật
Tiến hành lên men sinh khối sau khi đã nhân giống chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus đây là giai đoạn quan trọng vì nó tạo ra sản phẩm và tăng sinh khối. Quá trình này tiến hành cung cấp chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi được tối ưu để thu được sinh khối tốt nhất. Lên men sinh khối trong các bình có thể tích 1,5l bằng môi trường DSMZ – 27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC. Với tỉ lệ tiếp giống 10% chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus sau 72h sinh trưởng của vi khuẩn đang ở pha cân bằng tiến hành thu sinh khối.
Bảo quản
Sản phẩm được bảo quản trong bình kín không gây hại cho vi sinh vật, bảo quản ở nhiệt độ phòng, không tiếp xúc ánh sáng trực tiếp.
3.2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong các điều kiện bảo quản khác nhau
Chế phẩm sau khi tạo thành được cho bình kín chia hai lô bảo quản ở điều kiện chiếu sáng và che tối. Tiến hành xác định mật độ tế bào sau mỗi 15 ngày. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3. và hình 3.6.
Bảng 3.3. Mật độ tế bào vi khuẩn Rhodobacter capsulatus sau 60 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau.
Điều kiện bảo quản
Mật độ VSV (109 CFU/ml) sau số ngày
Ngày đầu Ngày 15 30 Ngày 45 Ngày 60 Ngày
Sáng 3,58.109 3,82.109 3,42.109 2,85.109 2,54.109 Tối 3,58.109 3.46.109 3,17.109 3,05.109 2,78.109
29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. Mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm lỏng khi bảo quản ở các điều kiện
khác nhau.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.3 và hình 3.6 cho thấy, sau 60 ngày bảo quản ở hai điều kiện chiếu sáng và che tối mật độ VK đều giảm nhưng vẫn đạt 109CFU/g đảm bảo chất lượng của một chế phẩm vi sinh theo quy định TCVN 7304-2:2003.
Tuy nhiên, mức độ giảm mật độ VSV ghi nhận ở 2 điều kiện bảo quản là khác nhau. Cụ thể, khi chế phẩm được bảo quản ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên, ghi nhận được sau 15 ngày đầu, mật độ tăng và đạt 3,82.109 (CFU/ml). Rhodobacter capsulatus là chủng VSV quang dưỡng nên khi chiếu sáng đã kích thích sự sinh trưởng của chúng, dẫn đến tăng mật độ tế bào. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian bảo quản, nhận thấy có sự giảm nhẹ mật độ tế bào, sau 60 ngày mật độ giảm 29% và đạt 2,54.109 (CFU/ml). Sự giảm của mật độ tế bào VK trong chế phẩm được giải thích do dinh dưỡng trong môi trường bị suy giảm một phần.
Khi chế phẩm vi khuẩn Rhodobacter capsulatus được bảo quản ở điều kiện che tối nhận thấy sau 2 tháng mật độ tế bào giảm còn 2,98.109 (CFU/ml) giảm 16% so với ban đầu, nhưng vẫn cao hơn mật độ tế bào cùng thời điểm ở điều kiện bảo quản chiếu sáng tự nhiên.
Từ kết quả trên đây, nhận thấy rằng với chế phẩm sinh học từ chủng Rhodobacter capsulatus khuyến cáo nên bảo quản ở điều kiện che tối để kéo dài thời gian sử dụng của chế phẩm.
3.3 Khảo sát hiệu quả xử lý nước thải hồ nuôi tôm của chế phẩm lỏng từ chủng
Rhodobacter capsulatus
Nước thải sau khi thu thập về từ các ao nuôi tôm ở Thăng Bình, Quảng Nam được lọc để loại bỏ cặn, chất thải rắn và được đưa đi tiệt trùng ở nhiệt độ 121◦ C trong thời gian
2E+09 2.5E+09 3E+09 3.5E+09 4E+09 4.5E+09 1 15 30 45 60 Mật độ tế bào (CFU/m l)
Thời gian (Ngày)
30
15 phút. Nước thải sau tiệt trùng được pha loãng với nước cất 10 lần và đưa đi xác định các thông số đầu vào như sau:
Bảng 3.4. Đặc điểm nước thải ao nuôi tôm ban đầu.
Thông số Đơn vị Giá trị
QCVN 40:2011/BTNMT Cột A Cột B pH - 6,7 6,0 – 9,0 5,5 – 9,0 NH4+-N mg/l 33,43 5 10 COD mg/l 1896 75 150 BOD5(20OC) mg/l 476 30 50
Từ kết quả trên cho thấy mức độ ô nhiễm của nước thải ao nuôi tôm tại địa điểm nghiên cứu khá cao chỉ có pH là đạt theo QCVN 40:2011/BTNMT, nước thải tại khu vực nghiên cứu ô nhiễm vì: NH4+-N cao gấp 3,34 lần, COD cao gấp 12,64 lần, BOD5 cao gấp 9,52 lần tiêu chuẩn xả thải ra môi trường so với cột B của Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN 40:2011).
Tiến hành bố trí xử lý nước thải theo 2 lô thí nghiệm (lô TN1: nước thải không xử lý và lô TN2: xử lý nước thải bằng chế phẩm lỏng từ chủng Rhodobacter capsulatus bổ sung 10% trong các bình 5l với các điều kiện cố định: pH = 7, nhiệt độ 30-32◦C và chiếu sáng tự nhiên. Nghiên cứu được tiến hành trong 12 ngày để xác định sự thay đổi của các chỉ tiêu NH4+-N, COD sau mỗi 3 ngày thí nghiệm, pH và BOD5 của nước thải đầu vào và đầu ra sau 12 ngày xử lý.
a. Sự thay đổi của hàm lượng NH4+ trong nước thải
31
Hình 3.7. Sự thay đổi hàm lượng NH4+ sau 12 ngày xử lý.
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy sau 12 ngày xử lý hàm lượng NH4+ ở lô thí nghiệm đối chứng là nước thải không xử lý bằng chế phẩm nồng độ NH4+ không có sự thay đổi do vi sinh có trong nước thải không còn tồn tại sau khi hấp ở nhiệt độ cao. Ở lô thí nghiệm dùng chế phẩm để xử lý hàm lượng NH4+ sau 12 ngày xử lý giảm còn 12,43 mg/l (hiệu suất 68%). Nước thải đầu ra có chỉ tiêu NH4+ đạt điều kiện xả thải loại B QCVN 40:2011/BTNMT. Sự giảm của hàm lượng NH4+ trong nước thải do quá trình đồng hóa kị khí của vi khuẩn Rhodobacter capsulatus. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Xuejiao Huang và cộng sự (2018) nhận thấy chủng vi khuẩn Rhodobacter sp. có khả năng xử lý amoni trong nước thải cảnh quan đạt 99,76% sau khi đã chỉ ra sự dư thừa amoni là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng phú dưỡng. Việc không phát hiện NO2- -N và NO3-N trong các thí nghiệm của ông chỉ ra có thể chủng vi khuẩn này làm giảm amoni trong nước ở điều kiện kỵ khí do quá trình đồng hóa (Huang et al., 2018).Trong quá trình phát triển, vi khuẩn quang dưỡng sử dụng NH4+ làm nguồn nitrogen.Vi khuẩn quang hợp Rhodobacter capsulatus, hoạt động của nitrogenase được điều chỉnh bởi ADP-ribosyl hóa của thành phần II để phản ứng với việc bổ sung amoni vào môi trường nuôi cấy hoặc loại bỏ ánh sáng. Kích thích amoni dẫn đến ức chế nhanh chóng và gần như hoàn toàn hoạt động khử axetylen in vivo, được gọi là quá trình tắt, được đảo ngược sau khi amoni cạn