4. Nội dung nghiên cứu
3.1.2. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến sinh trưởng chủng vi khuẩn
Rhodobacter capsulatus trong chế phẩm
Với mục đích chọn lựa nguồn cơ chất thích hợp, dễ tìm kiếm, sử dụng thuận tiện và giảm giá thành cho sản xuất sinh khối. Rỉ đường là nguồn cơ chất thường được sử dụng để thay thế nguồn carbon trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bởi thành phần chủ yếu của rỉ đường là các loại glucid hòa tan (sucrose là chủ yếu), ngoài ra rỉ đường là một nguồn giàu khoáng và các sắc tố vitamin (Binkley & Wolform, 1953). Thành phần bột đậu nành chủ yếu là protein, carbohydrate, đường, cùng các loại khoáng chất và vitamin vì vậy có thể thay thế một số nguồn cơ chất trong môi trường dinh dưỡng để vi sinh vật phát triển.
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng tích lũy sinh khối của chủng Rhodobacter capsulatus trong môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung bột đậu nành (CT1), rỉ đường (CT2) với hàm lượng 2 g/l và chỉ sử dụng môi trường DSMZ27 cải tiến (CT3). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên. Kết quả xác định mức độ tích lũy sinh khối ở OD660 được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Mật độ VSV trong các công thức chế phẩm khác nhau. Công thức Mật độ VSV (109 CFU/ml) sau số ngày
1 2 3 4 5 CT1 (Đậu nành) 9.62 9.70±0.02 a 9.8±0.01a 10.14±0.14a 10.54±0.06a CT2 (Rỉ đường) 9.62 9.66±0.01 a 9.84±0.01a 9.97±0.02a 10.09±0.04a CT3 (Không bổ sung) 9.62 9.63±0.01b 9.66±0.03b 9.72±0.03b 9.80±0.01b
Chú thích: kí hiệu a,b biểu diễn sự sai khác có ý nghĩa ở mức (p<0,05) theo cột, giá trị bằng giá trị trung bình±SD (n=3)
25
Hình 3.2. Mật độ VSV trong các công thức chế phẩm khác nhau.
Hình 3.3. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn Rhodobacter capsulatus trên các nguồn cơ chất thay thế (p=value<0.05).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.2, hình 3.2 và hình 3.3 cho thấy, chủng Rhodobacter capsulatus có khả năng sinh trưởng trên cả ba nguồn cơ chất là rỉ đường, bột đậu nành và đối chứng (MT DSMZ27 cải tiến), tuy nhiên với nguồn cơ chất là bột đậu nành nhận thấy mất độ tế bào vi khuẩn là cao nhất, đạt 1,054.109 CFU/ml. Theo hình 3.3 so sánh tốc độ sinh trưởng của chủng Rhodobacter capsulatus sau 5 ngày trên các nguồn cơ chất thay thế cho kết quả tốc độ sinh trưởng của chủng vi khuẩn trên nguồn cơ là có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong nghiên cứu cho thấy, tốc độ sinh trưởng của công thức môi trường DSMZ- 27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành cao hơn khi bổ sung công thức bổ sung 2 (g/l) rỉ đường và môi trường không bổ sung thêm cơ chất gì. Bột đậu nành là cơ chất giàuprotein và các khoáng chất, thích hợp cho chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus sinh trưởng và phát triển. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của khảo sát của Đỗ Thị Liên và
9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 1 2 3 4 5 Mật độ tế bào (CFU/m l)
Thời gian (Ngày)
26
cộng sự năm 2015 nhận thấy với chế phẩm lỏng từ các chủng Rhodobacter spp. trên nguồn cơ chất bột đậu nành cho thấy chất lượng chế phẩm đạt tốt nhất (Đỗ Thị Liên, 2015).
Do vậy có thể sử dụng nguồn cơ chất là đậu nành cho nuôi cấy sản xuất sinh khối trên quy mô lớn do dễ tìm kiếm và giá thành rẻ nên chúng tôi lựa chọn bột đậu nành để sản xuất sinh khối Rhodobacter capsulatus ở quy mô lớn.
3.1.3. Quy trình công nghệ tạo chế phẩm lỏng từ chủng Rhodobacter capsulatus
Quy trình công nghệ tạo chế phẩm lỏng từ chủng Rhodobacter capsulatus được thể hiện ở sơ đồ sau:
Hình 3.4. Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh lỏng
27
Hình 3.5. Quy trình nhân giống chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus.
Hoạt hóa giống
Chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus đã được phân lập và giữ giống trong ống effendol bằng glyxerol trong tủ lạnh âm sâu ở -4oC. Tiến hành hoạt hóa trên môi trường đặc trưng DSMZ 27 có bổ sung 2% agar bằng phương pháp cấy ria từ ống giống được bảo quản bằng glyxerol. Sau đó tiến tục nhân nhanh sinh khối bằng các lấy khuẩn lạc đơn trên đĩa đã ria cho vào 50ml môi trường DSMZ27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành lỏng trong bình tam giác 250ml đã được khử trùng ở điều kiện 121oC, 1 atm trong thời gian 20 phút, tiến hành nuôi trong điều kiện ánh sáng tự nhiên ở nhiệt độ 30-32oC. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660) (Myers et al., 2013). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ Jascop V-750.
Nhân giống cấp 1
Từ chủng vi khuẩn đã hoạt hóa bắt đầu tiến hành nhân giống cấp 1 sử dụng 200ml môi trường DSMZ -27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành được chuẩn bị trong các bình thủy tinh có dung tích 250ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, trong vòng 21 phút. Để nguội môi trường trong tủ cấy và tiến hành tiếp giống 10% chủng
Rhodobacter capsulatus. Nuôi dưới ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC sau 48 – 60h khi vi sinh vật đang ở pha sinh trưởng mật độ đạt 109 CFU/ml tiến hành cấy chuyển nhân giống
28
cấp 2. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ.
Nhân giống cấp 2
Sau khi nhân giống cấp 1 trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC sau 48 – 60h khi vi sinh vật đang ở pha sinh trưởng mật độ đạt 109 CFU/ml tiến hành cấy chuyển nhân giống cấp 2 sử dụng 400ml môi trường DSMZ -27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành được chuẩn bị trong các bình thủy tinh có thể tích 500ml hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, trong vòng 21 phút.Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 660nm (OD660). Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ.
Lên men sinh khối vi sinh vật
Tiến hành lên men sinh khối sau khi đã nhân giống chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus đây là giai đoạn quan trọng vì nó tạo ra sản phẩm và tăng sinh khối. Quá trình này tiến hành cung cấp chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi được tối ưu để thu được sinh khối tốt nhất. Lên men sinh khối trong các bình có thể tích 1,5l bằng môi trường DSMZ – 27 cải tiến có bổ sung 2 (g/l) bột đậu nành ở điều kiện chiếu sáng tự nhiên, nhiệt độ 30 – 32oC. Với tỉ lệ tiếp giống 10% chủng vi khuẩn Rhodobacter capsulatus sau 72h sinh trưởng của vi khuẩn đang ở pha cân bằng tiến hành thu sinh khối.
Bảo quản
Sản phẩm được bảo quản trong bình kín không gây hại cho vi sinh vật, bảo quản ở nhiệt độ phòng, không tiếp xúc ánh sáng trực tiếp.