Đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế chịu lạnh ở thực vật. Antonio F Monroy
&cs. (1993) đã báo cáo về vai trò của Ca2+ đối với những thay đổi do stress lạnh trong quá trình phosphoryl hóa protein, biểu hiện gen và khả năng chịu lạnh ở cây alfalfa (Medicago sativa spp. Falcata cv Anik). Cây này là loại thực vật chịu lạnh. Thí nghiệm xử lý chất hóa học để ngăn chặn các kênh Ca2+, gây tác dụng đối kháng peaceodulin hoặc ức chế kinase protein đã hạn chế khả năng chịu lạnh của tế bào nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào.
Phân tích thuộc tính của phosphoprotein bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide hai chiều cho thấy ở nhiệt độ thấp, mức độ phosphoryl hóa tương đối của một số protein tăng lên, trong khi đó một số khác lại giảm. Khi xử lý lạnh cùng với sự có mặt của N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene-sulfonamide hydrochloride, một chất đối kháng của peaceodulin và protein kinase + Ca2+, chất ức chế kênh Ca2+ đã làm quá trình phosphoryl hóa protein bị ức chế mạnh mẽ, các tế bào mất khả năng năng chịu lạnh và sự tích lũy các tRNA của các gen đặc
10
hiệu thích nghi lạnh đã giảm đáng kể. Ở công thức xử lý 1- (5- isoquinolinesulfonyl) -2-methylpiperazine dihydrochloride (một chất ức chế protein kinase, có tác dụng ít rõ rệt hơn đối với quá trình phosphoryl hóa protein khi bị lạnh) cho kết quả chỉ gây ra sự ức chế một phần khả năng chịu lạnh. Những kết quả này cho thấy Ca2+ và phosphoryl hóa protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình chịu lạnh. Vai trò của Ca đến biểu hiện gen chịu lạnh ở lúa cũng đã được phát hiện. Setsuko Komatsu & cs. (2007) đã tiến hành xử lý lạnh ở
5 °C trong 3 ngày các dòng lúa biến đổi gen có liên quan đến cấu trúc của các protein chịu lạnh mà sự tổng hợp được điều chỉnh bởi sự có mặt của Ca (CDPK13, calreticulin và CRTintP1). Kết quả cho thấy sự tích lũy các protein chịu lạnh ở các giống lúa chịu lạnh cao hơn so với các giống lúa không chịu lạnh. Vai trò sinh lý của Ca cũng đã được báo cáo. Sally Wilkinson & cs. (2001) đã xử lý lạnh ở cây Commelina communis và thuốc lá (Nicotiana Rustica). Kết quả cho thấy các tế bào bảo vệ của cả hai loài ít nhạy cảm với ABA ngoại sinh, và không tích lũy KCl khi bị lạnh và làm khí khổng không thể đóng lại trừ khi calcium được cung cấp. Phân tích cho thấy, nhiệt độ thấp làm tăng độ nhạy của khí khổng
với CaCl2 thêm 50% ở cây C. Communis và 20% ở cây thuốc lá. Mặc dù khí
khổng của cây C. Communis nhạy cảm với calcium gấp 300 đến 1.000 lần ở nhiệt độ thấp so với khí khổng thuốc lá, nhưng biểu bì thuốc lá giải phóng lượng calcium gấp 13,6 lần vào dung dịch bào so với cây C. Communis. Kết quả đã cho thấy cơ chế đóng khí khổng ở các cây này khi bị lạnh được liên quan đến tăng sự hấp thu calcium apoplastic ở các tế bào bảo vệ. Phản ứng này không xảy ra trong lá cây thuốc lá nhạy cảm với lạnh.
Các nghiên cứu về khả năng chịu lạnh ở cây trồng đã được thực hiện tại Việt Nam nhưng tập trung ở lĩnh vực khảo sát và chọn giống. Nguyễn Văn Lộc & cs.
(2014) đã đánh giá khả năng chịu lạnh của 73 dòng lúa CSSL (dòng có đoạn thay thế nhiễm sắc thể) được chọn lọc từ phép lai giữa giống lúa Indica IR24 và Japonica Asominori. Hạt của các dòng lúa được nảy mầm 7 ngày trong các hộp thí nghiệm đặt trong hai buồng sinh trưởng (dung tích 300 lít) có nhiệt độ môi trường khác nhau: 13 °C (xử lý lạnh) và 28 °C (đối chứng) trong vòng 3 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thấp làm giảm 55-100% chiều dài rễ mầm, 82-100% chiều dài thân mầm và trên 60% lượng chất khô tích lũy của các dòng lúa thí nghiệm. Khối lượng chất khô tích lũy của thân mầm thời kỳ xử lý lạnh có liên quan đến khả năng chống chịu và khả năng phục hồi sau lạnh của các dòng lúa.
11
Kết quả đã chọn lọc được 10 dòng lúa có khả năng chịu lạnh tốt phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Nguyễn Văn Toàn (23) đã báo cáo hoàn thiện được quy trình nhân giống và trồng mới hai giống cao su chịu lạnh VNg 77-2 và VNg 77-4.
2.3.2. Nghiên cứu về khả năng chịu lạnh trên cây đậu đỗ
Những năm qua đã có một số thành công trong chọn tạo giống đậu xanh thích ứng cho vụ đông ở Việt Nam. Lê Khả Tường (14) đã khảo sát 108 mẫu đậu xanh và đã phân lập được 20 dòng/giống có tiềm năng năng suất cao và 30 dòng/giống chịu sâu bệnh thích ứng được với vụ xuân và thu đông ở miền Bắc Việt Nam. Trong số đó có các giống T135, V123 được coi là điển hình với năng suất cao thích ứng với vụ Đông miền Bắc Việt Nam.
Vai trò của calcium làm tăng khả năng chống chịu của đậu đỗ cũng đã được nghiên cứu. Trên cây đậu đũa cũng cho thấy, xử lý 50mM Ca(NO3)2 và 0,25mM SA riêng rẽ hoặc kết hợp đã cải thiện đáng kể khả năng chống chịu của cây đậu đũa trong điều kiện mặn 0,3% NaCl. Kết quả cho thấy khi bổ sung Ca2+ hoặc SA riêng rẽ đã làm tăng chiều cao cây, số lá, tỷ lệ Chla/Chlb, Chl tổng số/carotenoids, chỉ số huỳnh quang hữu hiệu Fv/Fm, cũng như sự tích lũy chất khô, chiều dài, chiều rộng của quả và số quả/cây. Công thức xử lý Ca2+ và SA đã làm giảm mức độ proline, độ rò rỉ ion màng, độ thiếu bão hòa nước, giảm hàm lượng H2O2 và MDA. Theo Nguyễn Thị Phương Dung và CS, xử lý SA làm giảm mức độ tăng của proline, MDA so với công thức hạn không bổ sung SA, nhưng chưa có tác động đáng kể đến hàm lượng H2O2 và chỉ số huỳnh quang của diệp lục Fv/Fm. Trong 2 nồng độ SA sử dụng, nồng độ SA 0,5 mM có hiệu quả tốt hơn so với nồng độ SA 0,25 mM (Nguyễn Thị Phương Dung & Trần Anh Tuấn, 2017).
2.4. NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NÂNG CAO KHẢ NĂNGCHỊU LẠNH CHỊU LẠNH
2.4.1. Sử dụng các hợp chất thứ cấp để nâng cao khả năng chịu lạnh
Các hợp chất thứ cấp như acid salicylic, methyl salicylic và acid jasmonic cũng đóng vai trò như các phân tử tín hiệu khởi động quá trình chịu lạnh ở cây trồng. Các hợp chất này khi được xử lý ngoại sinh cũng cải thiện đáng kể khả năng chịu lạnh. Xử lý 0,5 mM SA đã cải thiện khả năng chịu lạnh của ngô, dưa chuột và gạo đã được báo cáo bởi Kang & Saltveit (2002). SA ngoại sinh cũng làm giảm tổn thương gây ra bời sự đóng băng trong lá lúa mì trồng trong điều kiện nhiệt độ thấp (Taşgín & cs., 2003). Tổn thương do lạnh ở cây ớt chuông
12
xanh mới thu hoạch (Capsicum annuum) đã được giảm bớt khi xử lý hơi methyl SA và methyl jasmonate (JA) (Fung & cs., 2004). Việc giảm tổn thương lạnh này trong ớt chuông xanh có liên quan đến sự gia tăng biểu hiện của gen oxy hóa thay thế (AOX) gây ra bởi hơi methyl SA và methyl JA. Những quan sát này cho thấy một con đường hô hấp thay thế có liên quan đến phản ứng của thực vật đối với các stress lạnh. Xử lý acetyl SA (0,1 mM) hoặc methyl JA (3 μM) cải thiện đáng kể sự nảy mầm của hạt ở ớt ngọt cũng đx được báo cáo bởi Korkmaz (2005).
Sử dụng các hợp chất ngoại sinh như một biện pháp tác động đến hệ thống trao đổi chất và hệ thống chống oxy hóa khi bị lạnh ở đậu xanh (Vigna radiata
L.) đã được báo cáo bởi Saleh (2007). Tác giả đã sử dụng cây con hai mươi ngày tuổi được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm bằng nhau, nhóm thứ nhất được để lại trong ngôi nhà kính ở 35 °C, nhóm thứ hai được xử lý lạnh ở 5 °C trong 5 hoặc 10 giờ và nhóm thứ 3 được xử lý với 0,0; 25 và 50 mg/L paclobutrazol, 0,5 và 1 mM axit abscisic hoặc 0,1 và 0,5 mM H2O2 trước khi gây lạnh nhân tạo ở 5 °C. Kết quả cho thấy, stress lạnh làm tăng đáng kể peroxid hóa lipid, rò rỉ màng và mức độ hydrogen peroxide, trong khi các hoạt động của các enzymes chống ô-xy hóa là catalase, peroxidase và ascorbate peroxidase đã giảm. Ngoài ra, diệp lục và carbohydrate tổng số, hàm lượng protein và proline giảm sau khi tiếp xúc với
5°C. Các công thức xử lý bằng Paclobutrazol, axit abscisic và H2O2 đã cải thiện các tổn thương do lạnh bằng cách làm giảm peroxid hóa lipid, rò rỉ màng và mức độ H2O2 nhưng làm tăng hàm lượng diệp lục, carbohydrate, protein và proline; tăng các hoạt động của enzyme chống oxy hóa.
Nghiên cứu sử dụng các hợp chất ngoại sinh để tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng cũng đã được thực hiện tại Việt Nam. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Dung và CS (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của salicylic axit (SA)
ở2 mức nồng độ khác nhau (0,25 mM và 0,50 mM) đến cây dưa chuột trong điều kiện hạn nhân tạo bằng PEG - 6000. Kết quả cho thấy, hạn đã làm giảm mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của cây dưa chuột, nhưng khi bổ sung thêm SA vào các công thức hạn đã làm giảm tác động của hạn đối với cây dưa chuột ở giai đoạn cây con, thể hiện qua các chỉ tiêu về sinh trưởng và một số stress markers. Chiều cao cây tăng 1,2 lần, số lá, diện tích lá, chỉ số LAI tăng lần lượt là 1,66 lá/cây, 13,3 cm2 lá/cây, 1,2 lần; sự tích lũy chất khô tăng tương ứng là 1,7 và 4,5 lần ở thân là và ở rễ; hàm lượng diệp lục a, hàm lượng diệp lục b tăng từ 0,01 đến 0,06 mg, nhưng hàm lượng carotenoids lại giảm 0,01 mg ở công thức hạn có SA so với điều kiện hạn không có SA.
13
2.4.2. Vai trò của calcium đối với khả năng chịu lạnh ở cây trồng
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng calcium là một chất dẫn truyền tín hiệu thứ cấp quan trọng trong hệ thống truyền tín hiệu thực vật (Margarita Cacho & cs., 2013, Kazi Md Kamrul Huda & cs., 2013). Các kích thích môi trường đã gây ra sự tích lũy calcium nội bào và làm giảm sự nhày cảm của thực vật với môi trường, trong đó, calcium có thể kết hợp với các yếu tố nội bào khác như protein kinase hoặc tương tác với các con đường truyền tín hiệu khác. Ở thực vật, xử lý ngoại sinh của calcium đã tăng cường khả năng chống chịu đã được báo cáo như làm tăng khả năng chịu muối (Hrishikesh Upadhyaya & cs., 2011), chịu hạn
(Chengbin Xu & cs., 2013), chịu nóng (Sha Yang & cs., 2013) và chịu lạnh (B Zhou & Guo Z, 2009). Vai trò của calcium trong chống chịu của thực vật có lẽ tác động đến trao đổi chất ROS, tăng hiệu suất tăng trưởng, quang hợp và tích lũy nitơ.
Sự tham gia của tín hiệu calcium trong phản ứng với lạnh của các gen kinase ở cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. đã được báo cáo bởi Sari
Tähtiharju & cs. (1997). Phương pháp điều trị bằng hóa chất chelate calcium ngoại bào (EGTA) hoặc chặn các kênh calcium trên màng tế bào (La3+, Gd3+) đã ức chế sự thích nghi lạnh cũng như biểu hiện gen kinase. Ruthenium red, một chất ức chế giải phóng calcium nội bào bị ức chế một phần biểu hiện gen kinase (chất phát triển khả năng chịu lạnh). Một chất ức chế protein kinase phụ thuộc calcium (CDPK) và calmodulin ức chế sự thích nghi lạnh cũng như cảm ứng lạnh của gen kinase.
Vai trò của Ca2+ đối với những thay đổi do stress lạnh trong quá trình phosphoryl hóa protein, biểu hiện gen và sự phát triển của khả năng chịu lạnh ở cây Medicago sativa spp. Falcata cv Anik trong điều kiện in vitro đã được báo cáo bởi A. F. Monroy & cs. (1993). Các phương pháp xử lý hóa học để ngăn chặn các kênh Ca2+ bằng các chất có tác dụng đối kháng peaceodulin hoặc ức chế kinase protein (các chất liên quan đến khả năng chịu lạnh do stress lạnh nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào) đã được thực hiện. Phân tích thuộc tính của phosphoprotein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide hai chiều cho thấy ở nhiệt độ thấp, mức độ phosphoryl hóa tương đối của một số protein tăng lên, trong khi một số khác lại giảm. Khi ở điều kiện stress lạnh cùng với sự có mặt của N- (6-aminohexyl) -5-chloro-1-naphthalene-sulfonamide
14
hydrochloride, một chất đối kháng của peaceodulin và protein kinase phụ thuộc Ca2+, hoặc chất ức chế kênh Ca2+ , những thay đổi gây ra trong quá trình phosphoryl hóa protein bị ức chế mạnh mẽ, các tế bào mất khả năng phát triển khả năng chịu lạnh và sự tích lũy các mRNA của các gen đặc hiệu thích nghi lạnh đã giảm đáng kể. Một chất ức chế protein kinase, 1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methylpiperazine dihydrochloride, có tác dụng ít rõ rệt hơn đối với quá trình phosphoryl hóa protein gây stress lạnh và chỉ gây ra sự ức chế một phần sự chống chịu lạnh và sự tích tụ các mRNA chịu lạnh. Mức độ phosphoryl hóa của một protein, khoảng 15 kD, tăng hơn 10 lần ở nhiệt độ thấp và cho thấy mối tương quan dương chặt với khả năng chịu lạnh và biểu hiện gen ngay cả khi điều trị bằng hóa chất. Những kết quả này cho thấy Ca2+ và phosphoryl hóa protein, hoặc có lẽ là sự kết hợp của cả hai, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chống chịu lạnh.
Nghiên cứu của Haitao Shi & cs. (25) đac cho thấy calcium là yếu tố tín hiệu thứ cấp quan trọng liên quan đến phản ứng với stress lạnh của thực vật ở cả nhiệt độ lạnh (<20 ° C) và nhiệt độ đóng băng (<0 ° C). Trong nghiên cứu của các tác giả này, sử dụng calcium clorua (CaCl2) ngoại sinh của đã cải thiện cả khả năng chịu lạnh và sự đóng băng, trong khi ethylene glycol bis‐ (β‐ aminoethyl) ether N,N,N,N‐ tetraacetic acid (EGTA) đã đảo ngược tác dụng của CaCl2 ở cây Cynodon dactylon
(L.) Pers.). Các phân tích sinh lý cho thấy rằng việc xử lý CaCl2 làm giảm bớt sự tổng hợp các gốc oxy hóa (ROS) và gây tổn thương tế bào do stress lạnh, thông qua kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, tích lũy chất chống oxy hóa glutathione không enzyme, trong khi xử lý bằng EGTA gây tác dụng ngược lại. Ngoài ra, phân tích proteomic đã xác định được biểu hiện của 51 protein khác nhau được tổng hợp trong phản ứng chống oxy hóa, chu trình tricarboxylicacid, glycolysis, quang hợp, con đường pentose phosphate oxy hóa và chuyển hóa axit amin. Các thí nghiệm lặp lại đều cho thấy có 42 chất mà con đường chuyển hóa được điều chỉnh bằng cách xử lý CaCl2 khi bị stress lạnh bao gồm axit amin, axit hữu cơ, đường và rượu. Như vậy, xử lý CaCl2 trong điều kiện stress lạnh đã thay đổi chuyển hóa carbon và
chuyển hóa axit amin theo xu hướng tăng khả năng chịu lạnh. Nghiên
cứu này đã báo cáo bằng chứng đầu tiên về vai trò thiết yếu và bảo vệ của calcium nội sinh và ngoại sinh đối với stress lạnh, thông qua kích hoạt các chất chống oxy hóa và tổng hợp một số protein biểu hiện khác biệt và làm cân bằng nội môi chuyển hóa trong quá trình thích nghi với lạnh.
Nghiên cứu cho thấy kinase protein, bao gồm cả kinase protein phụ thuộc Ca2+ (CDPK), được biết là chất trung gian cho sự thích nghi của thực vật với những thay đổi môi trường khác nhau. Tuy nhiên, chức năng của hầu hết các CDPK nho chưa được làm rõ. Các nghiên cứu trước về biểu hiện gen CDPK cho thấy 10 gen CDPK của V. amurensis được tăng cường trong các phương pháp xử lý stress phi sinh học khác nhau. Trong đó, sự biểu hiện của gen VaCDPK20 được tăng cường đáng kể dưới stress nhiệt độ thấp và nhiệt độ cao ở cây V. amurensis. Kết quả nghiên cứu về vai trò của calcium đến khả năng chịu lạnh trên cây nho dại Vitis amurensis Rupr. đã được báo cáo bởi Alexandra S.
Dubrovina & cs. (2015). Trong nghiên cứu này, tác động của việc biểu hiện quá mức gen VaCPK20 trong các dòng tế bào callus của V. amurensis và cây chuyển gen của A. thaliana đối với các phản ứng của chúng đối với stress phi sinh học đã được nghiên cứu. Arabidopsis biến đổi gen biểu hiện gen VaCPK20 cho thấy khả