PHÂN LẬP TỪ GÀ MẮC BỆNH VỚI MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH VÀ THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ
4.4.1. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Sau khi quan sát các triệu chứng lâm sàng ở những đàn gà biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh ORT, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và gửi những mẫu của gà mắc bệnh về phòng Thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán thý y, Cục Thú y. Chúng tôi đã tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm nuôi cấy trên môi trường thạch máu Colombia Blood Agar (có bổ sung 5% máu thỏ/máu cừu và 10µg/ml Gentamycin), ở điều kiện 37ºC, CO2 5%, ủ trong thời gian 24 - 72 giờ để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn có trong cơ thể. Kết quả nuôi cấy được thể hiện thông qua hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ORT trên môi trường thạch máu
Kết quả hình 4.9 cho thấy: trên môi trường CBA (Columbia Blood Agar), khuẩn lạc phát triển thành những đám có kích thước khác nhau: là khuẩn lạc nhỏ, to bằng đầu đinh gim, tròn, đục, có mầu xám đến xám trắng hoặc gây dung huyết yếu hoặc không gây dung huyết. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã được công bố (Võ Thị Trà An & cs., 2014).
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành lấy khuẩn lạc đặc trưng kiểm tra một số phản ứng sinh hóa của chúng (Oxidase, catalase), kết quả được thể hiện thông qua hình 4.10.
Hình 4.10. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Thông qua kết quả hình 4.10 chúng tôi nhận thấy: với những khuẩn lạc của
vi khuẩn ORT trên môi trường CBA cho kết quả phản ứng Catalase âm tính (ORT không có men Catalase nên chúng không có khả năng phân hủy H2O2 tạo thành H2O và O2 vì vậy phản ứng không tạo bọt); phản ứng Oxidase dương tính (phản ứng chuyển thành màu tím than). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của (Mohammed Zahra et al, 2013; Võ Thị Trà An và cs, 2014).
Chúng tôi tiếp tục lựa chọn những khuẩn lạc điển hình trên, tăng sinh trên môi trường BHB, ủ 37ºC trong thời gian 24 giờ, CO2 5%. Tiến hành lấy canh khuẩn trên thử phản ứng Indol, kết quả thu được thể hiện thông qua hình 4.11.
Hình 4.11. Kết quả kiểm tra phản ứng Indol đối với vi khuẩn ORT
Như vậy, phản ứng Indol cũng cho kết quả âm tính (kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây)
Từ các kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn ra các mẫu cho kết quả phân lập đương tính, tiến hành chiết tách DNA của vi khuẩn ORT và tiến hành thực hiện phản
ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra có hay không DNA của vi khuẩn ORT trong canh khuẩn. Kết quả phản ứng PCR thực thể hiện thông qua hình 4.12.
Hình 4.12. Kết quả giám định sự có mặt của vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR
1. 100bp DNA ladder; 2. Đối chứng dương (ONL); 3. Đối chứng âm; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 là mẫu cần
giám định
Kết quả hình 4.12 cho thấy: đối chứng dương lên vạch, cho sản phẩm PCR như trong thiết kế (sản phẩm PCR thiết kế 784bp). Đối chứng âm không lên vạch tương đương đối chưng dương; chứng tỏ phản ứng hợp cách, cho độ tin cậy cao trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả. Các mẫu cần kiểm tra cho sản phẩm PCR nhỏ hơn 800bp (khoảng 784bp). Như vậy, trong canh khuẩn có chứa DNA của vi khuẩn ORT.
4.4.2. Kết quả xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT phân lập từ gà mắc bệnh với một số loại kháng sinh
Để xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT phân lập từ gà mắc bệnh với một số loại kháng sinh, từ đó làm cơ sở cho việc đưa ra phác đồ điều trị có hiệu quả là việc làm cần thiết trong bối cảnh hiện nay. Vì vậy, sau khi phân lập và giám định được các chủng vi khuẩn ORT đang lưu hành trên đàn gà tại huyện Bình Giang, tỉnh Hải Dương, chúng tôi tiến hành tăng sinh khuẩn lạc trên môi trường BHB, ủ 37ºC, 5% CO2 trong thời gian 24 - 48 giờ.
Pha loãng canh khuẩn đến nồng độ thích hợp (so với độ đục chuẩn). Tiến hành hút 100µl canh khuẩn trên cấy láng đều trên môi trường Mueller Hinton đã chuẩn bị sẵn. Đặt 7 loại kháng sinh đã lựa chọn vào 7 vị trí khác nhau trên đĩa (đã được đánh dấu trước); ủ 37ºC, 5% CO2 trong thời gian 24 - 48 giờ rồi tiến hành
đọc kết quả. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với 7 loại kháng sinh của vi khuẩn ORT phân lập được tại huyện Bình Giang, tỉnh Hải Dương được trình bày
ở Bảng 4.10 và hình 4.13.
Bảng 4.10. Kết quả thử tính mẫn cảm của ORT với một số loại kháng sinh
Stt Loại kháng sinh 1 Amoxicillin/Clavulanic acid 2 Ampicillin 3 Tetracycline 4 Erythromycine 5 Sulphamethaxazol/Trimethoprime 6 Lincomycine 7 Doxycycline T ỷ lệ ( % ) Loại kháng sinh
Hình 4.13. Kết quả thử tính mẫn cảm của ORT với một số loại kháng sinh
Kết quả bảng 4.10 cho thấy: trong tổng số 13 mẫu ORT phân lập được kiểm tra, mức độ mẫn cảm nhất với 2 loại kháng sinh Amoxicillin/Clavulanic acid và Tetracycline chiếm tỷ lệ 100% (13/13 mẫu); kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây (Võ Thị Trà An & cs., 2014). Tiếp đến là các loại kháng sinh Ampicillin chiếm tỷ lệ 92,13% (12/13 mẫu). Erythromycine là kháng sinh chuyên điều trị bệnh trên đường hô hấp; nhưng cho đến thời điểm kiểm tra, tỷ lệ kháng
thấp nhất (0%). Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: do các loại kháng sinh trên đã được sử dụng thường xuyên trong một thời gian dài tại các
trại nói chung và hộ gia đình nói riêng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung gây ra. Vì vậy, đã gây ra hiện tượng kháng thuốc của chủng vi khuẩn được kiểm tra hoặc chủng vi khuẩn được kiểm tra đã thu nạp được các plasmid kháng thuốc do hiện tượng truyền ngang giữa các loài vi khuẩn khác nhau gây nên.
Hình 4.14. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT đối với các loại kháng sinh trên thạch
1)Kháng sinh Sulphamethaxazol/Trimethoprime; 2) Amoxicillne/Clavulanic acid;
3) Ampicillin; 4) Tetracycline; 5) Lincomycine; 6) Doxycycline và 7) Erythromycin
Kết quả Hình 4.14 cho thấy: 2 loại kháng sinh Amoxicillne/Clavulanic acid và Tetracycline có vòng tròn vô khuẩn lớn nhất (khả năng mẫn cảm của vi khuẩn ORT với loại kháng sinh này là lớn nhất). Tiếp theo là kháng sinh Ampicillin vòng tròn vô khuẩn lớn; nhưng bên trong vòng tròn không được trong/thuần (không phát hiện thấy khuẩn lạc mọc bên trong vòng tròn vô khuẩn). Cuối cùng là kháng sinh Erythromycin; có vòng tròn vô khuẩn nhỏ nhất nhưng bên trong vòng tròn vô khuẩn không phát hiện thấy khuẩn lạc mọc (kích thước vòng vô khuẩn vẫn đạt ngưỡng mẫn cảm nhưng mẫn cảm yếu). Ba loại kháng sinh còn lại: Sulphamethaxazol/Trimethoprime, Lincomycine và Doxycycline đã bị vi khuẩn ORT kháng lại (khuẩn lạc vẫn phát triển bình thường xung quanh tấm kháng sinh.
Với kết quả thu được trong phòng thí nghiệm của nghiên cứu này có thể đưa ra khuyến cáo cho cán bộ thú y cơ sở: Amoxicillin và Tetracycline là hai loại kháng sinh đặc hiệu có thể dùng trong quá trình điều trị với vi khuẩn ORT (ngoài ra có thể sử dụng kháng sinh Erythromycine để điều trị trong trường hợp gà bị nhiễm vi khuẩn ORT). Tuy nhiên, cần có chiến lược và biện pháp cụ thể để hướng dẫn người chăn nuôi và các chủ trang trại sử dụng kháng sinh có ý thức và thận trọng, tránh hiện tượng vi khuẩn kháng đồng thời với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Có như vậy, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh mới đem lại hiệu quả cao như mong đợi.
4.4.3. Kết quả sử dụng một số loại kháng sinh phòng trị bệnh do vi khuẩn ORT gây ra ở gà
Dựa trên kết quả thử tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT với một số loại kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh trên 03 đàn gà tại 03 hộ chăn nuôi thuộc ba xã khác nhau. Tuy nhiên, do điều kiện thực tế tại huyện Bình Giang, tỉnh Hải Dương và trên thị trường không có sẵn một số loại kháng sinh như trong kết quả kháng sinh đồ. Nhưng, để đáp ứng được yêu cầu thực tế của sản xuất, chúng tôi đã tiến hành sử dụng các sản phẩm tương đương với các loại kháng sinh đã sử dụng làm kháng sinh đồ để điều trị bệnh. Kết quả thu được tổng hợp và trình bày thông qua Bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả sử dụng một số kháng sinh điều trị bệnh do ORT gây ra Loại kháng sinh Amoxin: 1ml/5-8kg bắp sâu 1 lần/ngày Eryvet powder: nước/ngày Tetracyclin hydroclorid: gam/lít nước uống hoặc 0,01- 0,04 gam/gà
Khi sử dụng kháng sinh Erythromycin điều trị chúng tôi thấy, sau 5- 7 ngày có 9 trong tổng số 15 con khỏi bệnh, chiếm tỷ lệ 60,00%; 6/15 con bị chết chiếm tỷ lệ 40,00%.
Với kháng sinh Tetracyclin hydroclorid, cho kết quả 8/15 con khỏi bệnh, chiếm tỷ lệ 53,33%; 7/15 con bị chết, chiếm tỷ lệ 46,67%. Điều này có thể được giải thích như sau: đây là bệnh phức hợp trên gà; các biểu hiện triệu chứng lâm sàng dễ chẩn đoán nhầm với các bệnh truyền nhiễm khác: Mycoplasma, viêm thanh khí quản truyền nhiễm... Mặt khác, khi nghi ngờ bệnh do vi khuẩn ORT gây ra; thời gian nuôi cấy và phân lập lâu (thời gian nuôi cấy 3-5 ngày, thời gian tăng sinh 1-2 ngày...). Do vậy, để tìm được kháng sinh điều trị thông qua phản ứng khuếch tán trên thạch cần ít nhất 13 ngày. Do đó, khi dùng kháng sinh điều trị thì bệnh của con vật đã trở nên trầm trọng, sức đề kháng yếu nên tỷ lệ chết là tương đối cao.
Tỷ lệ % 80 73.33 60 60 40 20 0
Amoxi Eryvet powder Tetracyclin hydroclorid
Loại kháng sinh
Hình 4.15. Tỷ lệ gà khỏi bệnh khi sử dụng một số kháng sinh điều trị bệnh do ORT gây ra
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ