2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Mồi xuôi (10µM) 0,5 Mồi ngược (10µM) 0,5 RT/Platium Taq 0,5 Nước cất 6,0 Tổng số 25,0
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ
nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC Tgg CAA TTT GAA TG-3’; PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’; CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’; CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho PRRSV
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho CSFV
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 43 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và
polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo
bản gel.
Chuẩn bị gel: hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X,
đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
• Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn
DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
• Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ
100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
• Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quảđiện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.6.6. Phương pháp PCR
3.6.6.1 Tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)