Mẫu hải miên A. aaptos (30 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối, ngâm chiết siêu âm với MeOH (3 lần 50 lít, mỗi lần 2h), sau khi thu được dịch chiết cất loại bỏ dung môi ở áp suất giảm thu được 490g cặn MeOH. Cặn dịch này được bổ sung thêm 2 lít nước và chiết phân lớp bằng dung môi dichloromethane (2 lần2 lít), dịch chiết này được cất quay để loại bỏ dung môi thu được cặn chiết AD (215,0 g) và dịch nước.
Cặn chiết dichloromethane AD được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol: 1/0→ 0/1, v/v) thu được 7 phân đoạn AD1-AD7. Phân đoạn AD2 (15,3 g) được đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1,5/1, v/v) thu được 4 phân đoạn AD2A - AD2D. Phân đoạn AD2B (1,79 g) được đưa lên cột pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (8/1, v/v) để tinh chế, thu được hợp chất AA6 (18,2 mg). Tiếp tục đưa phân đoạn AD2C (1,55 g) lên cột pha thường với hệ dung môi rửa giải ethylacetate/methanol/nước (9/1/0,1, v/v/v) thu được hợp chất AA2 (13,9 mg) và hợp chất AA7 (20,6 mg). Phân đoạn AD5 (21,3 g) được tách trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải hexane/ethyl acetate (3/1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn AD5A-AD5E. Hợp chất AA3 (9,0 mg) và AA8 (22,1 mg) thu được từ phân đoạn AA5A (3,4 g) sử dụng sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (10/1, v/v). Tiếp tục tinh chế phân đoạn AD5C (2,5 g) trên cột pha thường với dichloromethane/acetone (2/1, v/v) là dung môi rửa giải, thu được hợp chất AA4 (5,3 mg). Phân đoạn AD5D (1,1 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 3 phân đoạn AD5D1-AD5D3. Phân đoạn AD5D3 có lượng chất nhỏ (100 mg) nên được đưa lên cột HPLC (ODS H-80, 250mm×20mm), với hệ dung môi rửa giải là 15% ACN, thu được hợp chất AA9 (9,8 mg). Cuối cùng, phân đoạn AD5E (1,5 g) được sắc kí trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (1/1, v/v), sau đó tiếp tục tinh chế các phân đoạn này bằng cột pha thường với dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được hợp chất AA1 (6,4 mg) và AA5 (9,6 mg).
34
A: Acetone H: n-hexan c.c: Column chromatography M: Methanol D: Dichloromethane W: Nước EtOAc: Ethyl acetate ACN: Acetonitrile HPLC: High Performance Liquid Chromatography
Aaptos aaptos (30 kg tươi)
Chiết với methanol (3 lần × 50 L) Sau đó quay cất thu hồi dung môi
Methanol ext. (490.0 g )
Bổ sung nước và chiết phân lớp với dung môi dichloromethane, Sau đó quay cất thu hồi dung môi
Cặn CH2Cl2 (215.0 g)
Lớp nước
Gradient Silica gel c. c. D/M: 1/0→0/1
AD1 (39.0 g) AD2 (15.3 g) AD3 (18.1 g) AD4 (11.3 g) AD5 (21.3 g) AD6 (74.4 g) AD7 (35.6g)
RP-18 c. c. M/W: 1.5/1
Silica gel c. c. H/E: 3/1
AD2A (1.5 g) AD2B (1.79 g) AD2C (1.55 g) AD2D (1.34 g) AD5A (3.4 g) AD5B (4.5 g) AD5C (2.5 g) AD5D (1.1 g)
Silica gel c. c
AD5E (1.5 g)
RP-18 c. c. Silica gel c. c.
D/A: 8/1 Silica gel c. c. E/M/W: 9/1/0.1
Silica gel c. c.
D/M: 10/1 Silica gel c. c. D/A: 2/1
H/E: 2/1 A/W: 1/1
AD5D1 AD5D2 AD5D3
(100 mg) AD5E1 (16 mg) AD5E2 (125 mg) 15 % ACN Silica gel c. c. D/E 2:1 Silica gel c. c. D/E 2:1 AA5 (9.6 mg)
AA6 AA2 AA7 AA3 AA8 AA4 AA9 AA1