2.4.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
- Enzyme Taq ADN Polymerase 2.5U. - dNTPs gồm : ATP, TTP, GTP, CTP.
- Cặp mồi (primer): Cặp mồi được sử dụng để xác định Hib là Haem
Right:
+ Primer 1:
5’ CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG 3’.
+ Primer 2:
5’ GCCATTCATCAAATA 3’.
Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo tồn của gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của Hi. Cả hai mồi bao
gồm khoảng 24 bases.
- Thang ADN mẫu dùng trong diện di gen - Đệm, nước khử ion và MgCl2 25mM.
2.4.1.2. Các bước chẩn đoán PCR:
- Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy
+ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch, vô trùng.
+ Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun sôi 15 phút. + Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau khi đã đun cách thủy) với tần số 10000 vòng/ phút ì 5 phút.
+ Lấy 10àl nước nổi sau khi ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN
- Tiến hành kỹ thuật
/ Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 50àL, trong đó chứa: 1,5 àL (1,5mM) MgCl2; 1 àL (0,2 mM) dNTP; 5 àL (1X) 10X PCR buffer (KCl, Tris-HCl, Mg); 0,5 àL (2,5U) Taq ADN polymerase; 10 àL ADN
mẫu Haemophilus influenzae (ATCC 35056 Difco làm chứng dương), 40 àL nước khử ion và cặp mồi (mồi 1,2: 2 àL hoặc 40pm) cho mỗi ống.
/ Hỗn hợp phản ứng được chạy theo chương trình cài đặt của máy điều nhiệt (Ependorff, Germany) khoảng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cú cỏc thông số dưới đây: giai đoạn biến tính khoảng 2 phút ở 94oC; giai đoạn gắn mồi khoảng 2 phút ở 56oC; giai đoạn kéo dài khoảng 2 phút ở 72oC. Trong đó, giai đoạn biến tính đầu tiên cần 10 phút ở 94oC và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 8 phút ở 72oC. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể được giữ ở 4oC cho đến khi phân tích.
Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn đoán Hib được phát hiện bởi thạch điện di agarose.