6. Bố cục đề tài
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 800 hãng Perkin Elmer của Trung tâm khí tượng thủy văn thành phố Đà Nẵng .
- Thiết bị đo sắc ký khí gh p phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C. Cột sắc kí HP5MS (dài 30m; đường kính trong 0.25mm; lớp phim dày 0.25µm) của Trung tâm Đo Lường khu vực 2, TP.Đà Nẵng.
- Máy đo hoạt tính sinh học của trung tâm Hà Nội. - Tủ sấy Memmert VM 400 khoảng nhiệt độ 30-280oC.
- Lò nung Nabertherm L3/6C khoảng nhiệt độ nung 30- 1100oC. - Cân phân tích satorius CP224S.
- Máy quay cất chân không Buchi- Vacuum Controller V-800.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc...
2.2.2. Hóa chất
Một số hóa chất thuốc thử chính được sử dụng chính được nêu trong Bảng 2.1. Ngoài ra còn có một số hóa chất khác.
Bản 2.1. Dan m c óa c ất sử d n
STT TÊN HÓA CHẤT NƢỚC SẢN XUẤT
1 n-hexane Trung Quốc
2 Dichloromethane Trung Quốc 3 Ethyl acetate Trung Quốc
4 Methanol Trung Quốc
5 HNO3 đậm đặc Trung Quốc 6 HCl đậm đặc Trung Quốc
2.3. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.3.1. Phƣơng ph p x c định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm của thân lá mỗi loại bòng bong và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phư ng pháp trọng lượng.
b. Phương pháp vật lý
Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu được xác định phư ng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
2.3.2. Phƣơng ph p chiết mẫu thực vật
a. Chiết bằng dung môi hữu cơ với thân lá cây bòng bòng dẻo (L. Flexuosum)
Mẫu thực vật đã sấy khô là thân lá của mỗi loại đã được nghiền nhỏ tiến hành chiết lần lượt với từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau như n– hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol.
b. Chiết bằng dung môi hữu cơ với thân lá cây bòng bong nhật (L.Japonicum)
Mẫu thực vật đã sấy khô là thân lá của mỗi loại đã được nghiền nhỏ tiến hành chiết lần lượt với từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau như n– hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol
2.3.3. Phƣơng ph p phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết
Trong luận văn này chúng tôi phân tích và định danh thành phần hóa học các dịch chiết n-hexane, dicloromethane và ethyl acetate, methanol của mẫu thân lá cây bòng bòng nhật và mẫu thân lá cây bòng bong dẻo bằng phư ng pháp đo sắc kí khí gh p phổ khối (GC-MS).
Phư ng pháp GC - MS dựa trên c sở “nối gh p” máy sắc kí khí (GC) với máy khối phổ (MS). Các chất sau khi đi qua cột GC có thể bị ion hóa và có khả năng đầy đủ để phân tích bởi máy khối phổ MS. Kĩ thuật sắc kí cho ph p tách các cấu tử của hỗn hợp, có được các chất “nguyên chất” để đưa vào máy khối phổ với khả năng nhận diện rất ưu việt, đặc biệt là những chất có đặc trưng lưu giữ giống nhau hoặc tư ng tự nhau nhưng có phổ khối khác nhau nhờ đó có thể nhận diện được chúng. Phư ng pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc h i mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể h i.
Hìn 2.4. Hệ t ốn sắc kí k ố p ổ
2.3.4. Phƣơng ph p thử hoạt tính kháng khuẩn
Tiến hành thăm dò hoạt tính kháng sinh và hoạt tính chống oxi hóa từ dịch chiết thân lá cây bòng bong nhật tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật và nấm sau dùng để thử nghiệm:
Gram (+) - Staphylococcus aureus - Bacillus subtilis - Lactobacillus fermentum Gram (-) - Salmonella enterica - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa Nấm Candida albicans
2.4. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.4.1. Sơ đồ thực nghiệm 2.4.1. Sơ đồ thực nghiệm
2.4.2. X c định các thông số hóa lí của nguyên liệu
a. Xác định độ ẩm
♦ D n c , t ết bị : ch n sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
♦ Tiến hành: chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các chén sứ.
♦ Xác địn độ ẩm của nguyên liệu : lấy vào 6 chén sứ, 3 chén mỗi chén đựng khoảng 3 gam thân lá cây bòng bong nhật và 3 chén mỗi ch n đựng khoảng 3 gam thân lá bòng bong dẻo đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ). Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 900C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và chén sứ giữa 2 lần cân không đổi (sai số ±0.001 gam) là được. Ghi lại giá trị khối lượng đó. Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân. Từ đó suy ra độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
♦ Các tín độ ẩm: - Độ ẩm mỗi mẫu: 0 1 0 m -m % 100% m (2.1) - Độ ẩm trung bình: 3 1 TB (%) (%) 3 (2.2) Trong đó, m0 (gam) : Khối lượng của lá và thân cây bòng bong
m1 (gam): Khối lượng của lá và thân cây bòng bong sau khi sấy (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu
TB (%) : Độ ẩm trung bình
b. Xác định hàm lượng tro
toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
♦ D ng c : chén sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
♦ Tiến hành: Để xác định hàm lượng tro trong thân lá cây bòng bong nhật và thân lá cây bòng bong dẻo, ta lấy vào 6 chén sứ, 3 chén mỗi chén đựng khoảng 2 gam thân lá bòng bong nhật và 3 chén khác mỗi ch n đựng khoảng 2 gam bòng bong dẻo đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ). Cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 5000C-5500C (nếu nhiệt độ cao h n thì một số các kim loại sẽ bị bay h i). Sau thời gian tro hoá khoảng 12 giờ, ta thấy thân lá mỗi loại cây bòng bong bị tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng bột mịn, màu xám trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng. Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra, thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số ± 0.001 thì dừng lại. Hàm lượng tro trong thân lá cây bòng bong nhật và thân lá cây bòng bong dẻo được tính theo công thức: 1 0 .100% m H m (2.3) Trong đó,
m0 (gam): khối lượng mẫu thân lá cây bòng bong nhật hoặc bòng bong dẻo trước khi tro hoá
m1 (gam): khối lượng tro của thân lá cây bòng bong nhật hoặc bòng bong dẻo sau khi tro hóa
H (%): hàm lượng tro trong thân lá cây bòng bong nhật hoặc bòng bong dẻo
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
vô c hóa về dạng muối vô c dễ hòa tan, lấy một mẫu tro hòa tan trong dung dịch dung dịch HNO3 1% và định mức đến 100 ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Hg, As, Pb, Cd, Cu, Zn bằng phư ng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại trung tâm khí tượng thủy văn thành phố Đà Nẵng.
Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau: (mg/l) (mg/kg) 0 C C 100 m (2.4)
Trong đó, m0 : khối lượng mẫu thân lá cây bòng bong nhật hoặc thân lá cây bòng bong dẻo trước khi tro hóa.
2.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng cuả thời gian đến quá trình chiết tách
Yếu tố thời gian: hiệu suất của quá trình chiết các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại.
Cân một lượng khoảng 10 gam các mẫu thân lá cây bòng bong nhật, sau đó cho một lượng dung môi xác định 150 ml của cùng một dung môi. Tiến hành chiết bằng phư ng pháp chiết soxhlet với nhiệt độ như nhau, tùy thuộc vào từng dung môi trong khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ ,10 giờ, 12 giờ.
Cô quay dung môi của các dịch chiết thu được cặn ở các thời gian chiết khác nhau, đem cân. Chọn thời gian chiết hiệu quả nhất.
Tư ng tự, tác giả cũng tiến hành khảo sát như trên cho các mẫu thân lá bòng bong dẻo.
2.4.4. Chiết t ch và x c định thành phần hóa học của các dịch chiết thân lá cây bòng bong nhật hoặc bòng bong dẻo
Khoảng 10g nguyên liệu thân lá cây bòng bong nhật và thân lá cây bòng bong dẻo được chiết soxhlet lần lượt trong 4 dung môi n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate, methanol trong 150 ml dung môi.
Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5 ml để đem phân tích GC – MS xác định thành phần và hàm lượng các cấu tử có trong mỗi dịch chiết. Hệ thống GC- MS với cột tách mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, thể tích tiêm mẫu 1μl (split 10:1), gh p máy MS EI+
k m ngân hàng dữ liệu và theo chư ng trình gradient nhiệt độ: từ 500C đến 3000
C (5 phút); injector 2500C và detector 500, chế độ qu t Fullscan.
Kết luận
Nguyên liệu được sử dụng trong đề tài này là: thân lá cây bòng bong nhật và thân lá cây bòng bong dẻo được thu hái tại Điện Bàn, Quảng Nam.
Sau khi tiến hành các bước xử lý để việc bảo quản được tốt h n thì tiến hành đánh giá các chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại để đánh giá chất lượng nguyên liệu theo quy chuẩn của Dược điển Việt Nam.
Trong đề tài này, sử dụng phư ng pháp chiết bằng dụng cụ Soxhlet lần lượt qua các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate. Quá trình này được khảo sát thời gian chiết đối với từng dung môi riêng biệt để thu được dịch chiết tối ưu. Sau đó xác định thành phần hóa học của các dịch chiết n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol từ cả thân lá mỗi loại bòng bong bằng phư ng pháp sắc ký khí gh p khối phổ. Bên cạnh việc tìm hiểu về thành phần của một loại nguyên liệu thì việc đánh giá một loại nguyên liệu có được đưa vào sử dụng như một loại dược liệu trong y học phụ thuộc rất lớn vào hoạt tính của các chất trong thành phần của nó. Vì vậy, sau khi xác định được thành phần hóa học của các dịch chiết tác giả tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của bốn dịch chiết từ bòng bong nhật để đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Độ ẩm 3.1.1. Độ ẩm
Xác định độ ẩm là công việc đầu tiên cần phải làm khi tiến hành xác định chất lượng một nguyên liệu. Do hàm lượng các hoạt chất như tinh dầu, glycoside, alkaloid… đều được quy định tính trên trọng lượng khô tuyệt đối của nguyên liệu.
Chính vì vậy, việc xác định độ ẩm ngoài việc kiểm tra để quá trình bảo quản đạt yêu cầu còn giúp cho việc đánh giá hàm lượng hoạt chất được chính xác.
Tiến hành xác định độ ẩm của mẫu thân lá bòng bong nhật và thân lá bòng bong dẻo theo mục 2.3.2 thu được kết quả được nêu trong Bảng 3.1 và 3.2.
Bản 3.1. Kết quả xác địn độ ẩm của thân lá cây bòng bong n ật
STT
Độ ẩ của thân lá bòng bong nhật
m0 (g) m1 (g) ѡ (%) 1 3,741 3,595 3,902 2 3,821 3,683 3,349 3 3,634 3,512 3,357 4 3,397 3,271 3,709 5 3,567 3,438 3,616 Độ ẩm trung bình 3,587
Bản 3.2. Kết quả xác địn độ ẩm của thân lá cây bòng bong dẻo
STT
Độ ẩ của thân lá cây bòng bong dẻo
m0 (g) m1 (g) ѡ (%) 1 3,347 2,092 3,749 2 3,513 3,402 3,159 3 3,608 3,473 3,741 4 3,281 3,162 3,626 5 3,125 3,012 3,534 Độ ẩm trung bình 3,562 Trong đó: w : Độ ẩm (%)
m0 : Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m1 : Khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
Nhận xét: độ ẩm trung bình của cả thân lá bòng bong nhật và bòng bong dẻo khô xác định được lần lượt là 3,587% và 3,562%. So sánh với độ ẩm an toàn được quy định trong Dược điển Việt Nam IV là 9% đến 12% thì mẫu thân lá bòng bong nhật, bòng bong dẻo khô xác định được là đạt yêu cầu. Với độ ẩm này, tác giả đã bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài nhưng không bị mốc, không có những thay đổi về mặt cảm quan và nguyên liệu có độ ổn định tốt.
3.1.2. Tro toàn phần
Xác định hàm lượng tro toàn phần cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng giúp chúng ta dự đoán được hàm lượng kim loại trong nguyên liệu. Việc tiến hành xác định tro toàn phần trong mẫu nguyên liệu khô theo mục 2.4.2 thu được kết quả được nêu trong Bảng 3.3 và 3.4.
Bản 3.3. Kết quả xác địn tro toàn p ần tron thân lá bòng bong n ật
STT
Hà ƣợng tro toàn phần trong thân lá bòng bong nhật Khối ƣợng ẫu g Khối ƣợng tro g T ệ tro
1 2,134 0,065 3,045
2 2,056 0,061 2,966
3 2,157 0,058 2,688
Trung bình 2,899
Bản 3.4. Kết quả xác địn tro toàn p ần tron thân lá bòng bong dẻo
STT
Hàm lượng tro toàn phần trong thân lá bòng bong dẻo
Khối ƣợng ẫu (g) Khối ƣợng tro g T ệ tro (%)
1 2,082 0,074 3,554
2 2,103 0,076 3,613
3 2,043 0,065 3,181
Trung bình 3.449
Nhận xét: hàm lượng tro trong mẫu nguyên liệu thân lá cây bòng bong nhật và thân lá cây bòng bong dẻo sau khi nung trung bình lần lượt là 2,899% và 3,449%, rất thấp so với hàm lượng tro toàn phần của một số dược liệu được quy định Dược điển Việt Nam IV. Với giá trị này, ta dự đoán được hàm lượng kim loại trong mẫu nguyên liệu là rất ít.
3.1.3. Hà ƣợng kim loại nặng
Nguyên liệu có thể nhiễm một số kim loại nặng từ đất, nước… Vì vậy, khi tiến hành nghiên cứu nguyên liệu nào đó ta không chỉ quan tâm nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học mà cần phải nghiên cứu và kiểm tra khống chế các chất có hại để không ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng. Từ đó,
chọn ra các nguồn nguyên liệu an toàn để đưa vào sử dụng. Việc tiến hành xác định hàm lượng tro trong mẫu được thực hiện theo mục 2.4.3. với phư ng pháp thử TCVN 6193 – 1996. Kết quả được nêu trong Bảng 3.5 và 3.6.
Bản 3.5. Kết quả xác địn àm lượn k m loạ n n trong thân lá cây bòng bong n ật
STT Ch tiêu Kết quả g kg Hà ƣợng cho phép g kg
1 Hg 0,0072 1,000 2 As 0,0051 1,000 3 Pb 0,3341 0,050 4 Cd 0,3254 2,000 5 Cu 2,1588 30,000 6 Zn 4,8721 40,000
Bản 3.6. Kết quả xác địn àm lượn k m loạ n n trong thân lá cây bòng bong dẻo
STT Chỉ tiêu Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho ph p (mg/kg)
1 Hg 0,0086 1,000 2 As 0,007 1,000 3 Pb 0,4523 1,000 4 Cd 0,3189 2,000 5 Cu 3,1267 30,000 6 Zn 4,9524 40,000
Nhận xét: qua Bảng 3.5 và 3.6 tác giả nhận thấy thành phần kim loại nặng có trong thân lá bòng bong nhật, và thân lá bòng bong dẻo tư ng đối thấp. Kết quả so sánh với giới hạn kim loại nặng trong các loại rau quả khô