7. Cấu trúc luận văn
1.3. TỔNG QUAN NGUỒN NGUYÊN LIỆU, SẢN PHẨM
1.3.1. Protein
Protein là những đại phân tử đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ
các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
Hình 1.13. Cấu trúc xoắn alpha của protein A: mô hình giản lược, B: mô hình phân tử,
C: nhìn từ đỉnh, D: mô hình không gian
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N. Một số còn chứa một lƣợng nhỏ S. Tỷ lệ phần trăm khối lƣợng các nguyên tố này trong phân tử protein nhƣ sau:
C: 50-55%, H: 6,5-7,3%, O: 21-24%, N: 15-18%, S: 0-0,24%
Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lƣợng rất nhỏ các nguyên tố khác nhƣ: P, Fe, Zn, Mn, Ca…
Protein đƣợc cấu tạo từ đơn vị cơ bản là các axit amin. Axit amin đƣợc cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (- COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin. Ngƣời ta đã phát hiện ra đƣợc tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống. [19]
hoặc
1.3.2. Các phƣơng pháp thu hồi protein
Để thu hồi protein trong dung dịch thì quan trọng nhất là phải có phƣơng pháp thích hợp nhất. Mỗi công nghệ, phƣơng pháp đều có ƣu, khuyết điểm nhất định. Do đó, tùy theo điều kiện của mỗi công ty, chi phí đầu tƣ, thời gian, chi phí năng lƣợng, hoá chất, nhân công, hiệu suất thu hồi…và chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc sẽ mang lại giá trị lợi nhuận cho nhà sản xuất bao nhiêu và quan trọng nhất có giải quyết đƣợc vấn đề ô nhiễm môi trƣờng cho công ty hiện nay hay không mà chúng ta chọn công nghệ, phƣơng pháp cho thích hợp.
Các phƣơng pháp thu hồi protein chính:
a. Phương pháp kết tủa
Đây là phƣơng pháp ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp để thu nhận chế phẩm protein từ dung dịch. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dƣới tác động của các yếu tố bên ngoài tƣơng tác giữa protein với nƣớc, giữa protein với protein, giữa protein với các thành phần khác sẽ bị thay đổi, dẫn đến kết quả là làm giảm khả năng tan của protein trong dung dịch, các phân tử protein tập hợp lại thành một khối kết tủa và tách ra khỏi dung dịch. Tùy theo tác nhân gây biến tính mà sự biến tính của protein đƣợc chia thành 2 dạng:
- Biến tính thuận nghịch: Là dạng biến tính thƣờng gây ra những thay đổi bên ngoài phân tử nhƣ: sự phá vỡ lớp vỏ hydrate trên bề mặt phân tử protein hay điện tích của các phân tử bị trung hòa. Bên cạnh đó biến tính thuận nghịch cũng có thể biến đổi về mặt cấu trúc không gian của phân tử protein mà nguyên nhân là do có sự phá hủy các liên kết trong phân tử. Chủ yếu là do các liên kết nhƣ liên kết ion, liên kết hydro, liên kết kỵ nƣớc (liên kết Van der Wals) bị phá vỡ tƣơng ứng với các cấu trúc bậc 4, bậc 3 bị thay
đổi chuyển thành cấu trúc bậc 2 thậm chí cấu trúc bậc 2 bị thay đổi một phần. Nói chung ở đây hầu nhƣ không có sự phân hủy các liên kết bền trong phân tử (tiêu biểu là liên kết cầu nối disulfua). Chính vì thế mà khi tác nhân gây biến tính đƣợc loại ra thì các cấu trúc ban đầu của phân tử protein đƣợc phục hồi trở lại (biến tính thuận nghịch).
- Biến tính không thuận nghịch: Là dạng biến tính gây ra những biến đổi sâu sắc, dẫn đến mất khả năng phục hồi trở lại cấu trúc ban đầu của phân tử protein. Khi đó các liên kết hóa học yếu có trong phân tử kể cả một số liên kết mạnh nhƣ cầu disulfua cũng bị phá hủy. Đầu tiên phân tử protein duỗi mạch chuyển về cấu trúc đơn giản (bậc 1 hoặc bậc 2), sau đó có thể hình thành những liên kết mới, trong trƣờng hợp này do mất đi các liên kết bền ban đầu mà phân tử protein không còn khả năng phục hồi lại cấu trúc tự nhiên ngay cả khi tác nhân gây biến tính đƣợc loại bỏ, điều này cũng đồng nghĩa với việc phân tử protein bị mất đi các tính chất ban đầu. Trên cơ sở đó phƣơng pháp kết tủa gây biến tính không thuận nghịch đƣợc ứng dụng rất nhiều để thu nhận protein với mục đích giữ lại các giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. Tùy vào điều kiện cụ thể mà các tác nhân gây biến tính đƣợc ứng dụng độc lập hay phối hợp với nhau sao cho quá trình thu nhận đạt đƣợc hiệu quả mong muốn.
* Kết tủa bằng điều chỉnh pH
Do tính chất phân li lƣỡng cực nên khi hòa tan trong dung dịch, ở một giá trị pH nhất định các phân tử protein chủ yếu ở dạng lƣỡng cực với các nhóm amin bị proton hóa (nhận proton), còn các nhóm carboxyl bị phân ly (mất proton). Khi đó do tích diện cùng dấu nên các phân tử protein có lực đẩy tỉnh điện. Ngoài ra bề mặt các phân tử protein cũng đƣợc bao quanh bởi lớp vỏ hydrat, cho nên trạng thái của dung dịch keo protein đƣợc duy trì. Bằng các tác nhân axit, kiềm, ta có thể điều chỉnh pH của dung dịch protein về một giá trị mà tại đó điện tích của các phân tử protein bị trung hòa, khiến cho lực
đẩy tĩnh điện của các phân tử bị mất đi, đồng thời sự tƣơng tác giữa các phân tử protein với các phân tử nƣớc bị giảm, dẫn đến lớp vỏ hydrate bên ngoài bị phá vỡ, làm tăng tƣơng tác giữa các phân tử protein, tạo điều kiện cho các phân tử protein tập hợp lại với nhau hình thành kết tủa. Ở đây do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân tử protein có thể hòa tan trở lại. Mặt khác, trong trƣờng hợp pH của dung dịch thay đổi quá thấp hoặc quá cao thì biến tính không thuận nghịch có thể xảy ra. Khi đó điện tích các nhóm phân cực mạch bên của axit amin thay đổi, tạo ra lực đẩy tỉnh điện giữa các nhóm bị ion hóa nên làm giản mạch các phân tử protein, các nhóm kỵ nƣớc xuất hiện trên bề mặt, tƣơng tác giữa các protein chiếm ƣu thế, kết quả là các phân tử protein tiến lại gần nhau làm xuất hiện kết tủa. Vì cơ chế kết tủa bằng pH có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ đƣợc hoạt tính và cấu trúc phân tử tuy nhiên thời gian tủa thƣờng xảy ra rất lâu, hiệu suất thu hồi lại thấp và chi phí cao nên hiệu quả kinh tế không cao.
* Kết tủa bằng nhiệt độ
Khi đun nóng sẽ làm phá lớp vỏ điện tích và làm giảm khả năng hydrate hóa của phân tử protein. Khi nhiệt độ tăng, chuyển động nội tại của các phân tử protein tăng làm phá vỡ các liên kết hydrogen giữa các phân tử protein, do đó khả năng hấp thụ nƣớc của protein bị giảm. Ngoài ra khi đun nóng sẽ gây biến tính và tập hợp protein làm cho bề mặt của phân tử protein bị giảm, do đó khả năng giữ nƣớc của các nhóm có cực ở protein cũng giảm. Dƣới tác dụng của nhiệt độ cao, các liên kết sẽ bị phá hủy, các cấu trúc bậc 2 bậc 3 và bậc 4 trong phân tử protein bị giãn mạch, xuất hiện các nhóm kỵ nƣớc trên bề mặt phân tử protein, làm giảm tƣơng tác giữa protein với nƣớc nên gây kết tủa protein. Tất cả các trƣờng hợp biến tính ở nhiệt độ cao đều là biến tính không
thuận nghịch do khi đó cầu disulfua hầu nhƣ bị phá hủy hoàn toàn. Mỗi loại protein khác nhau đều có nhiệt độ biến tính khác nhau, cƣờng độ và thời gian quyết định mức độ biến đổi protein, trong đa số các trƣờng hợp các protein đều bắt đầu biến tính ở nhiệt độ khoảng 45 - 500C, nhiệt độ càng tăng thì mức độ biến tính càng sâu sắc. Bên cạnh đó các yếu tố nhƣ hoạt độ nƣớc, pH của môi trƣờng, hàm lƣợng muối, bản chất và nồng độ của các chất khác cũng có ảnh hƣởng nhất định. Protein khi đƣợc gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn, do đó ngƣời ta thƣờng dùng cách này để phân lập và tinh chế protein từ lactoserum, máu hoặc huyết tƣơng. Tuy nhiên ngƣời ta cũng nhận thấy một số trƣờng hợp protein kết tủa ở nhiệt độ thấp (trƣờng hợp protein của trứng, sữa). Điều này cũng đƣợc giải thích là do các protein có tỷ lệ các axit amin kỵ nƣớc/ axit amin háo nƣớc cao nên nhiệt độ thấp làm giảm liên kết hydro giữa protein và nƣớc, tăng tƣơng tác giữa protein với protein, làm xuất hiện kết tủa. Vì vậy phƣơng pháp này rất ƣu việt trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó. Ngƣợc lại để thu nhận enzyme cần phải tiến hành ở nhiệt độ thấp. Phƣơng pháp kết tủa bằng nhiệt xảy ra nhanh hơn, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trƣờng. Bên cạnh các ƣu điểm, nó còn có những nhƣợc điểm chi phí năng lƣợng cho quá trình này là quá lớn.
* Kết tủa muối trung tính
Khi cho dung dịch muối trung tính vào dịch chứa protein, muối sẽ hòa tan làm tăng nồng độ các ion trong dung dịch, khi đó sự cạnh tranh nƣớc giữa các ion muối trung tính và phân tử protein. Ở nồng độ muối thấp thì độ tan của protein xem nhƣ tỷ lệ với nồng độ muối (tỷ lệ thuận với lực ion trong dung dịch). Khi nồng độ muối tăng thì độ tan của protein sẽ tăng dần và độ tan của protein sẽ đạt cực đại ở một giá trị nào đó của nồng độ muối (điểm tích muối), khi đó nếu nồng độ muối tiếp tục tăng thì độ tan của protein sẽ
giảm do tƣơng tác muối - nƣớc lúc này sẽ tăng mạnh dẫn đến làm giảm tƣơng tác giữa muối và protein, lớp vỏ hydrate trên bề mặt phân tử protein sẽ bị phá vỡ. Thêm vào đó các ion của muối trung tính sẽ bám trên bề mặt phân tử protein tạo thành lớp có điện tích trung hòa, kết quả làm cho kết tủa protein. Nồng độ của dung dịch muối cần dùng tùy thuộc vào bản chất của protein trong dung dịch. Các ion âm và ion dƣơng trong phân tử muối sẽ quyết định hiệu quả của loại muối đó, cụ thể là: Hiệu quả của các ion âm sẽ giảm dần theo thứ tự sau: phosphate > sulfate > acetate > choride. Các ion dƣơng cho hiệu quả cao thƣờng đƣợc sử dụng là: NH4+
> K+ > Na+. Trong đó, muối đƣợc sử dụng nhiều nhất là muối (NH4)2SO4 với lý do là giá thành rẽ độ hòa tan cao. Tỷ trọng của dung dịch (NH4)2SO4 bảo hòa ở khoảng 1,235 g/ml với nồng độ tƣơng ứng là 4 M. Muối thƣờng đƣợc bổ sung vào ở dạng dung dịch, nhƣng khi không muốn thể tích dung dịch này bị thay đổi thì dùng muối ở dạng bột. Nồng độ muối kết tủa thƣờng dùng là 50 - 80% độ bảo hòa. Lƣợng muối trong sản phẩm có thể tách ra bằng cách lọc qua màng thẩm tích. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là không gây biến tính không thuận nghịch protein, nên có thể ứng dụng để tinh sạch enzyme. Ngoài ra, với lớp ion muối bao quanh bề mặt phân tử protein có tác dụng ngăn cản sự thủy phân protein, chống lại tác động của vi sinh vật. Tuy nhiên, lƣợng hóa chất sử dụng có thể gây ô nhiễm môi trƣờng, hiệu suất tủa không cao nên khó triển khai ở qui mô công nghiệp.
* Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ tan trong nƣớc nhƣ: ethanol, acetone, methanol, isopropanol... khi đƣợc bổ sung vào dung dịch protein, một mặt vừa làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, khiến cho tƣơng tác giữa các phân tử protein tăng lên. Mặt khác do tính chất háo nƣớc nên khi cho vào dung dịch protein, các phân tử dung môi hữu cơ sẽ hút nƣớc, làm giảm tƣơng tác giữa nƣớc và
phân tử protein, dẫn đến sự phá vở lớp vỏ hydtrate của phân tử protein làm gây kết tủa protein. Nồng độ ion trong dung dịch có ảnh hƣởng đến quá trình kết tủa. Nồng độ ion trong dung dịch khoảng 0,05 M - 0,2 M là thích hợp. Với nồng độ ion cao hơn thì lƣợng dung môi nhiều hơn và nguy cơ biến tính tăng lên. Nếu nồng độ ion quá thấp thì kết tủa thu đƣợc sẽ quá mịn và khó tách. Nếu điều chỉnh pH của dung dịch về giá trị pI thì quá trình kết tủa xảy ra nhanh hơn và nồng độ dung môi hữu cơ cũng sẽ thấp hơn. Bên cạnh đó kích thƣớc của các phân tử protein cũng ảnh hƣởng đến tốc độ của quá trình kết tủa, với các phân tử protein có kích thƣớc phân tử lớn thì sự kết tủa xảy ra nhanh chóng và dể dàng hơn các phân tử protein có cùng tính chất nhƣng có kích thƣớc nhỏ hơn. Acetone và ethanol là hai dung môi đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong việc kết tủa protein, trong đó aceton đƣợc sử dụng nhiều hơn và lƣợng dùng cũng ít hơn. Hầu hết các protein trong dung dịch sẽ kết tủa khi acetone trong dung dịch chiếm 50 %, còn đối với ethanol là 80%. Điều cần chú ý là để tránh nồng độ protein trở nên quá loãng khi thêm dung môi làm giảm hiệu quả kết tủa, cho nên dung dịch protein trƣớc đó cần có nồng độ protein lớn hơn 1 mg/ml. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là khi tủa ở nhiệt độ thấp protein không bị biến tính nên thích hợp để thu nhận enzyme, hormone...Tuy nhiên, lƣợng dung môi sử dụng là rất lớn nên gây ô nhiễm môi trƣờng và không kinh tế cho qui mô công nghiệp.
* Kết tủa bằng polymer hữu cơ
Hiện nay rất nhiều polyme đƣợc sử dụng để kết tủa protein nhƣ chitosan, alginate, PEG (polyethylene glycol) là các loại polyme hữu cơ dùng phổ biến để kết tủa protein từ dung dịch. Cơ chế của tác nhân này tƣơng tự nhƣ các dung môi hữu cơ, các polyme sẽ làm mất lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein gây nên kết tủa protein. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các kết tủa bằng polyme hầu nhƣ không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả
thu nhận cao. Do đó phƣơng pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác.
b. Phương pháp siêu lọc
Phân tử protein có kích thƣớc lớn nên không thể khuếch tán qua màng bán thấm. Do đó dƣới áp lực cao hoặc li tâm khi cho dung dịch protein qua màng bán thấm thì chỉ có nƣớc và các phân tử nhỏ khác có thể đi qua, các phân tử protein có thể bị giữ lại. Tuy nhiên, chi phí về thiết bị là rất lớn nên thông thƣờng chỉ đƣợc áp dụng ở qui mô phòng thí nghiệm, nhƣng ƣu điểm của phƣơng pháp này là protein thu nhận có độ tinh sạch cao.
c. Phương pháp hấp phụ bằng polymer
Dùng các polymer có kích thƣớc nhỏ để hấp phụ nƣớc và các phân tử nhỏ ra khác ra khỏi nƣớc thải có chứa protein. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để cô đặc dung dịch protein, tuy nhiên, hiệu suất thu hồi thấp do các phân tử protein có thể bị hấp phụ vào polymer nên việc ứng dụng còn rất hạn chế.
Ngoài các phƣơng pháp nêu trên còn có một số phƣơng pháp phân tích protein nhƣ phƣơng pháp sắc ký và phƣơng pháp điện di đƣợc áp dụng để tách riêng các protein từ một hỗn hợp. Các phƣơng pháp này hiện nay đƣợc sử dụng chủ yếu để phân tích protein ở quy mô phòng thí nghiệm. [11] [19][20]
1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC NƢỚC
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Vào năm 1982, E.M Civit và các đồng sự [12] đã tiến hành thực hiện xác