6. Bố cục đề tài
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lí
a. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm.
Tiến hành: Chuẩn bị 3 chén sứ có kí hiệu sẵn các mẫu, các chén sứ được rửa sạch sấy khô trong tủ sấy. Sau khi sấy xong lấy ra bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt được nhiệt độ phòng thì cân khối lượng của chén sứ, ta được giá trị m0 [12].
Lấy vào mỗi chén sứ khoảng 3 g bột rễ, lá bồ công anh. Ghi lại khối lượng nguyên liệu trong chén đã kí hiệu sẵn (m1). Tiến hành sấy trên tủ sấy ở nhiệt độ 1000C, cứ 2 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi đem cân, làm như vậy cho đến khi khối lượng của mẫu và chén không đổi (m2).
Độ ẩm của mỗi mẫu được xác định theo công thức:
0 1 2 1 100% m m m m W (2.1)
Độ ẩm trung bình của nguyên liệu
3 1 i Wtb Wi (2.2) Trong đó m0: khối lượng cốc (g)
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)
W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)
b. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm
Tiến hành: Mẫu rễ, lá bồ công anh sau khi xác định độ ẩm được giữ nguyên trong chén sứ để tiến hành xác định hàm lượng tro. Than hóa mẫu trên bếp điện. Sau đó tiếp tục tro hóa trong lò nung ở nhiệt độ 5000C trong 5 giờ [12]. Quá trình tro hóa kết thúc ta thu được tro trắng ngà, làm nguội trong bình hút ẩm, đem cân được m3.
Hàm lượng tro của mỗi mẫu được tính theo công thức 3 0
1
Mm m 100%
m (2.3) Hàm lượng tro trung bình của 3 mẫu: tb 3
1 M i Mi (2.4) Trong đó
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g) m0 : khối lượng cốc (g)
m3: khối lượng cốc và mẫu sau khi nung (g)
c. Xác định hàm lượng kim loại
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm
Tiến hành: Mẫu sau khi tro hóa thì đem axit hóa bằng dung dịch HNO3 1N và
định mức lên 25ml. Lọc 2 lần để loại cặn không tan sau khi tro hóa, thu được dung dịch trong suốt rồi cho vào ống chứa mẫu đem xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS [12].
2.3.2. Khảo sát điều kiện chiết thích hợp
a. Khảo sát thời gian chiết thích hợp
Hiệu suất chiết Soxhlet các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại.
Cân một lượng khoảng 20 gam bột rễ, lá cây bồ công anh, gói kĩ trong túi vải lọc, sau đó cho một lượng dung môi xác định (200 ml) vào bình cầu. Tiến hành chiết
Soxhlet với nhiệt độ tùy thuộc vào nhiệt độ sôi của từng dung môi. Tiến hành chiết Soxhlet trong các khoảng thời gian khác nhau (4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ) [11], [12], [14].
Sau đó tính khối lượng riêng dịch chiết, khối lượng cao trong các dịch chiết Soxhlet thu được, % cao chiết. Chọn thời gian chiết Soxhlet tối ưu để thu được dịch chiết có khối lượng riêng, khối lượng cao, % cao chiết lớn nhất.
b. Hiệu quả chiết bằng các dung môi
Từ kết quả khảo sát thời gian chiết thích hợp, so sánh các giá trị về khối lượng riêng của các dịch chiết và lượng cao thu được từ dịch chiết để xác định thời gian chiết tối ưu có khả năng thu được dịch chiết có khối lượng riêng, khối lượng cao, % cao chiết là lớn nhất.
2.3.3. Phương pháp tách chất
Dung môi chiết tách: n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol
Quy trình chiết tách:
+ Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet với các dung môi: n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol
+ Cân 20g bột nguyên liệu (rễ, lá cây bồ công anh) cần chiết Soxhlet cho vào túi vải lọc, sau đó đưa vào hốc chiết. Lắp bộ chiết Soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Lấy 200ml lần lượt các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol cho vào bình cầu, sau đó đưa bình cầu vào bếp cách thủy đã điều chỉnh nhiệt độ bay hơi thích hợp của dung môi để thực hiện quá trình chiết, dung môi bốc hơi từng phần được ngưng tụ nhỏ vào chất được chiết đựng trong một túi vải lọc và sau đó chảy ngược lại vào bình cầu chiết Soxhlet trong các khoảng thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Lấy dịch chiết Soxhlet rễ, lá cây bồ công anh bằng các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol ở thời gian tối ưu đem đuổi dung môi thu dịch cao chiết đem đo GC–MS [7], [11], [12], [14].
2.3.4. Phương pháp xác định thành phần hóa học
Thành phần hóa học của dịch chiết rễ, lá cây bồ công anh trong dung môi n- hexan, diclometan, etyl axetat, metanol được xác định bằng phương pháp sắc kí khí
ghép khối phổ (GC–MS).
Trong đó, hệ GC có cột tách mao quản Elite 35MS, kích thước: 30 m x 250 µm x 0.25 µm, khí mang He. Chương trình nhiệt độ : từ 50°C giữ 4 phút, tăng 5°C/phút đến 150°C giữ 5 phút, tăng 10°C/phút đến 280°C giữ 10 phút, thời gian chạy 52 phút. Buồng tiêm mẫu trước, khí mang He, kiểu chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 280oC, áp suất dòng khí mang 7.6522 psi, tỉ lệ chia dòng 10:1 [7], [11], [12], [14].
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa DPPH
a. Khái niệm về gốc tự do
Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người [10].
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde ( •–
2 O ), nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2. Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis).
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu [10].
b. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau:
- Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp. - Tiến hành nhanh chóng
- Thích hợp nhiều tác nhân chống oxi hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxi hóa cho các sản phẩm thực phẩm.
Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa
của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm. Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenylpicrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác [10], [17].
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau:
Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH
DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Hoạt tính chống oxi hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao
vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm.
2.4. SƠ ĐỒ QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ
3.1.1. Độ ẩm
Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ và lá bồ công anh khô được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W(%) Wtb(%)
1 38.129 3.009 40.957 6.015
2 38.114 3.014 40.929 6.603 6.287
3 37.879 3.011 40.702 6.244
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu lá cây bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W(%) Wtb(%) 1 38.239 2.996 40.996 7.977 2 37.994 3.012 40.769 7.869 8.219 3 38.023 3.006 40.764 8.812 Trong đó m0: khối lượng cốc (g)
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g) W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của rễ và lá bồ công anh khô lần lượt là 6.287% và 8.219%, đây là độ ẩm tương đối an toàn. Do đó có thể giữ được chất lượng tốt của nguyên liệu trong quá trình bảo quản, tránh sự xâm nhập của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và tổng hợp ở Bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong mẫu rễ bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m3 (g) % tro % trotb
1 38.129 3.009 38.268 4.619
2 38.114 3.014 38.250 4.512 4.616
3 37.879 3.011 38.021 4.716
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng tro trong mẫu lá bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m3 (g) % tro % trotb
1 38.239 2.996 38.392 5.107
2 37.994 3.012 38.157 5.412 5.303
3 38.023 3.006 38.185 5.389
Trong đó
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g) m0 : khối lượng cốc (g)
m3: khối lượng cốc và mẫu sau khi nung (g)
Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình trong mẫu rễ và lá bồ công anh khô lần lượt là 4.616% và 5.303%. Hàm lượng tro trung bình rất thấp, thấp hơn so với hàm lượng tro toàn phần của một số dược liệu (dạng lá và rễ) được quy định Dược điển Việt Nam IV. Với giá trị này, ta dự đoán được hàm lượng kim loại trong mẫu nguyên liệu là rất ít.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng của 1 số kim loại nặng trong mẫu rễ và lá cây bồ công anh được xác định bằng phương pháp đo AAS. Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6.
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong rễ cây bồ công anh
Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)
Cu 12.457 30.000
Cd 0.018 0.200
Pb 0.178 0.300
Hg 0.050 1.000
As 0.200 1.000
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong lá cây bồ công anh
Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)
Cu 9.782 30.000 Cd 0.017 0.200 Pb 0.256 0.300 Hg 0.060 1.000 As 0.312 1.000 Nhận xét:
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng của kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô và căn cứ vào quyết định của thông tư Ban hành các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm 2011 cho thấy hàm lượng một số kim loại nặng trong bồ công anh được trình bày ở bảng trên là hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người nên bồ công anh có thể dùng làm dược phẩm chữa bệnh.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI
Bởi vì, khi bắt đầu chiết các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn hơn (thường là hợp chất như nhựa, keo...). Do đó, nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong nguyên liệu. Nhưng nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây cản trở cho quá trình tinh chế hoặc một số chất sẽ bị phân hủy do quá trình gia nhiệt quá lâu. Vì vậy, cần phải khảo sát thời gian chiết thích hợp với từng thành phần nguyên liệu và dung môi [7], [12], [14].
Ở trong đề tài này, tôi tiến hành khảo sát yếu tố thời gian đi từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực: hexan, diclometan, etyl axetat, metanol với hai nguyên liệu là rễ cây bồ công anh và lá cây bồ công anh.
3.2.1. Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi n-hexan
Lấy 5 mẫu bột từng loại rễ, lá cây bồ công anh khô, mỗi mẫu có khối lượng 20g.