6. Bố cục đề tài
2.3.3. Phương pháp tách chất
Dung môi chiết tách: n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol
Quy trình chiết tách:
+ Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet với các dung môi: n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol
+ Cân 20g bột nguyên liệu (rễ, lá cây bồ công anh) cần chiết Soxhlet cho vào túi vải lọc, sau đó đưa vào hốc chiết. Lắp bộ chiết Soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Lấy 200ml lần lượt các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol cho vào bình cầu, sau đó đưa bình cầu vào bếp cách thủy đã điều chỉnh nhiệt độ bay hơi thích hợp của dung môi để thực hiện quá trình chiết, dung môi bốc hơi từng phần được ngưng tụ nhỏ vào chất được chiết đựng trong một túi vải lọc và sau đó chảy ngược lại vào bình cầu chiết Soxhlet trong các khoảng thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Lấy dịch chiết Soxhlet rễ, lá cây bồ công anh bằng các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol ở thời gian tối ưu đem đuổi dung môi thu dịch cao chiết đem đo GC–MS [7], [11], [12], [14].
2.3.4. Phương pháp xác định thành phần hóa học
Thành phần hóa học của dịch chiết rễ, lá cây bồ công anh trong dung môi n- hexan, diclometan, etyl axetat, metanol được xác định bằng phương pháp sắc kí khí
ghép khối phổ (GC–MS).
Trong đó, hệ GC có cột tách mao quản Elite 35MS, kích thước: 30 m x 250 µm x 0.25 µm, khí mang He. Chương trình nhiệt độ : từ 50°C giữ 4 phút, tăng 5°C/phút đến 150°C giữ 5 phút, tăng 10°C/phút đến 280°C giữ 10 phút, thời gian chạy 52 phút. Buồng tiêm mẫu trước, khí mang He, kiểu chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 280oC, áp suất dòng khí mang 7.6522 psi, tỉ lệ chia dòng 10:1 [7], [11], [12], [14].
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa DPPH
a. Khái niệm về gốc tự do
Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người [10].
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde ( •–
2 O ), nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2. Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis).
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu [10].
b. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau:
- Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp. - Tiến hành nhanh chóng
- Thích hợp nhiều tác nhân chống oxi hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxi hóa cho các sản phẩm thực phẩm.
Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa
của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm. Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenylpicrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác [10], [17].
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau:
Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH
DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Hoạt tính chống oxi hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao
vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm.
2.4. SƠ ĐỒ QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ
3.1.1. Độ ẩm
Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ và lá bồ công anh khô được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W(%) Wtb(%)
1 38.129 3.009 40.957 6.015
2 38.114 3.014 40.929 6.603 6.287
3 37.879 3.011 40.702 6.244
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu lá cây bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W(%) Wtb(%) 1 38.239 2.996 40.996 7.977 2 37.994 3.012 40.769 7.869 8.219 3 38.023 3.006 40.764 8.812 Trong đó m0: khối lượng cốc (g)
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g) W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của rễ và lá bồ công anh khô lần lượt là 6.287% và 8.219%, đây là độ ẩm tương đối an toàn. Do đó có thể giữ được chất lượng tốt của nguyên liệu trong quá trình bảo quản, tránh sự xâm nhập của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và tổng hợp ở Bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong mẫu rễ bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m3 (g) % tro % trotb
1 38.129 3.009 38.268 4.619
2 38.114 3.014 38.250 4.512 4.616
3 37.879 3.011 38.021 4.716
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng tro trong mẫu lá bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m3 (g) % tro % trotb
1 38.239 2.996 38.392 5.107
2 37.994 3.012 38.157 5.412 5.303
3 38.023 3.006 38.185 5.389
Trong đó
m1: khối lượng mẫu ban đầu (g) m0 : khối lượng cốc (g)
m3: khối lượng cốc và mẫu sau khi nung (g)
Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình trong mẫu rễ và lá bồ công anh khô lần lượt là 4.616% và 5.303%. Hàm lượng tro trung bình rất thấp, thấp hơn so với hàm lượng tro toàn phần của một số dược liệu (dạng lá và rễ) được quy định Dược điển Việt Nam IV. Với giá trị này, ta dự đoán được hàm lượng kim loại trong mẫu nguyên liệu là rất ít.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng của 1 số kim loại nặng trong mẫu rễ và lá cây bồ công anh được xác định bằng phương pháp đo AAS. Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6.
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong rễ cây bồ công anh
Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)
Cu 12.457 30.000
Cd 0.018 0.200
Pb 0.178 0.300
Hg 0.050 1.000
As 0.200 1.000
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong lá cây bồ công anh
Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)
Cu 9.782 30.000 Cd 0.017 0.200 Pb 0.256 0.300 Hg 0.060 1.000 As 0.312 1.000 Nhận xét:
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng của kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô và căn cứ vào quyết định của thông tư Ban hành các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm 2011 cho thấy hàm lượng một số kim loại nặng trong bồ công anh được trình bày ở bảng trên là hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người nên bồ công anh có thể dùng làm dược phẩm chữa bệnh.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI
Bởi vì, khi bắt đầu chiết các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn hơn (thường là hợp chất như nhựa, keo...). Do đó, nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong nguyên liệu. Nhưng nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây cản trở cho quá trình tinh chế hoặc một số chất sẽ bị phân hủy do quá trình gia nhiệt quá lâu. Vì vậy, cần phải khảo sát thời gian chiết thích hợp với từng thành phần nguyên liệu và dung môi [7], [12], [14].
Ở trong đề tài này, tôi tiến hành khảo sát yếu tố thời gian đi từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực: hexan, diclometan, etyl axetat, metanol với hai nguyên liệu là rễ cây bồ công anh và lá cây bồ công anh.
3.2.1. Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi n-hexan
Lấy 5 mẫu bột từng loại rễ, lá cây bồ công anh khô, mỗi mẫu có khối lượng 20g. Tiến hành chiết Soxhlet với 200ml dung môi n-hexan trong các khoảng thời gian là 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Làm bay hơi dịch chiết sau mỗi lần chiết bằng thiết bị cất quay chân không cho đến thể tích còn lại là 50 ml. Cho 50ml dịch chiết vào bình tỷ trọng (đã biết khối lượng) đem cân khối lượng thu được m (gam) và khối lượng riêng của dịch chiết được xác định theo:
ddịch chiết = m m (g/ml)
V50
Cho 50 ml dung môi n-hexan vào bình tỷ trọng, đem cân khối lượng và tính được mdung môi = 32.405 (g), từ đó suy ra dn-hexan = 0.6481 (g/ml)
Khối lượng cao chiết được tính theo:
mcao = Vdịch chiết(ddịch chiết – ddung môi)
a. Kết quả khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan
* Khảo sát thời gian chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan
- Kết quả khảo sát thời gian chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan được trình bày ở Bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan theo thời gian Thời gian (h) m (g) m1 (g) m2 (g) d (g/ml) V (ml) d1 (g/ml) mcao (g) 4 37.815 18.953 56.768 0.6481 50 0.7563 5.410 6 38.009 18.953 56.962 0.6481 50 0.7602 5.604 8 39.030 18.953 57.983 0.6481 50 0.7806 6.625 10 39.035 18.953 57.988 0.6481 50 0.7807 6.630 12 39.038 18.953 57.991 0.6481 50 0.7808 6.633
Trong đó : m1 : khối lượng bình tỷ trọng (g)
m2 : khối lượng bình tỷ trọng và dịch chiết (g) m : khối lượng dịch chiết (g) với m = m2 – m1
V : thể tích của dịch chiết (ml)
d: khối lượng riêng của dung môi (g/ml) d1 : khối lượng riêng của dịch chiết (g/ml) mcao: Khối lượng cao chiết (g)
Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 4 giờ lên 8 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết tăng lên nhưng khi tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết tăng ít. Ở giai đoạn trên 8 giờ, khả năng hòa tan của các cấu tử trong dung môi n-hexan đã đạt đến độ bão hòa, do vậy việc tăng thời gian chiết gần như không còn ý nghĩa. Vậy thời gian chiết thích hợp để thu dịch chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n–hexan là 8 giờ và với thời gian này thì khối lượng riêng của dịch chiết, khối lượng cao thu được là
ddịch chiết = m 39.030
0.7806 (g/ml)
V 50
mcao = Vdịch chiết(ddịch chiết – ddung môi) = 50 (0.7806 – 0.6481) = 6.625 (g)
* Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan
hexan có màu xanh vàng nhạt được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết n-hexan từ rễ cây bồ công anh được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC-MS, sắc kí đồ được thể hiện ở Hình 3.1 và kết quả định danh thành phần hóa học được tổng hợp ở Bảng 3.8.
Hình 3.1. GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ cây bồ công anh
Bảng 3.8. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan từ rễ cây bồ công anh
S T T
Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lưu
Công thức cấu tạo
1 Pulegone 0.22 10.535 2 Cyclohexaone, 5- methyl-2-(1- methylethenyl)-, trans- 1.02 10.687
S T T
Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lưu
Công thức cấu tạo
3 Cyclohexaone, 1- methylene-3-(1- methylethenyl)-, (R)- 0.34 12.488 4 n-hexadecanoic acid 0.86 30.799 5 Phytol 0.62 35.176 6 Campesterol 2.99 44.530 7 Stigmasterol 7.33 44.865 H H H O H 8 beta.-Sitosterol 6.76 45.566 CH3 CH3 C H3 CH3 CH3