M Ở ĐẦU
6. Tổng quan tài liệu
1.5. TÍNH DIỆT KHUẨN CỦA HẠT NANO BẠC
Hiện nay, một số vi khuẩn ngày càng kháng thuốc kháng sinh nên các nhà khoa học đang tập trung đi tìm các tác nhân mới để diệt chúng và hạt nano bạc là một trong những chất được tập trung nghiên cứu mạnh nhất.
Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ <100ppm) [21].
Cơ chế diệt khuẩn của keo nano bạc [11, 16, 18]
Cơ chế kháng vi sinh vật nano bạc vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng tỏ chủ yếu sự tấn công của hạt bạc đến vi khuẩn tập trung vào lớp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn. Các hạt nano bạc sau khi đã chuyển sang dạng ion thì có khả năng tấn công vào nhiều vị trí trong tế bào vi sinh vật, vô hiệu hóa các chức năng của tế bào và làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp của tế bào, quá trình vận chuyển qua màng
tế bào, quá trình phiên mã, dịch mã các RNA, DNA. Đồng thời, các hạt nano bạc có kích thước nhỏ chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzym hay DNA có chứa nhóm sunphua, nhóm phốtphát hoặc kết hợp với các nhóm chức tích điện âm khác trong khắp tế bào vi khuẩn gây bất hoạt enzym hay DNA dẫn đến gây chết tế bào [16]. Vì vậy, hạt nano bạc được sử dụng làm tác nhân diệt khuẩn.
Hình 1. 33. Cơ chế diệt khuẩn keo nano bạc
Trước sự gia tăng của dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh điển hình là S.aureus hay các loại vi nấm gây bệnh thực vật thiếu thuốc đặc trị thì việc lựa chọn các chế phẩm chứa nano bạc đang rất được quan tâm.
Thông thường nồng độ bạc sử dụng cho việc kháng khuẩn và sát trùng rất thấp khoảng 5ppm cho việc diệt vi khuẩn Esherichia Coli hiệu quả đến 99,9% và khuẩn Staphylococcus aureus là hơn 99%.
Vì vậy, nano bạc rất hữu ích cho việc sử dụng làm chất diệt khuẩn, diệt nấm gây bệnh trong các bệnh viện nhằm hạn chế đến mức thấp nhất việc lây lan các chủng vi khuẩn ảnh hưởng đến cuộc sống con người.
Các yếu tốảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn của keo nano bạc
Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tốảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.
+ Kích thước hạt nano bạc là yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt khuẩn của chúng. Hạt nano bạc có kích thước càng nhỏ thì khả năng diệt khuẩn của chúng càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên, các hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ tạo thành các hạt lớn hơn gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản keo nano bạc. Do đó, trong quá trình chế tạo chúng ta phải tìm ra các phương pháp vừa tạo ra hạt nano bạc có kích thước nhỏ vừa bền vững.
+ Các hạt nano có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình que, hình cầu, hình tam giác,…Các hạt nano bạc ứng với các hình dạng khác nhau thì phân bố không giống nhau. Các hạt nano bạc có hình tam giác cụt có tính kháng khuẩn cao hơn các hạt hình cầu và các hạt hình que có tính kháng khuẩn thấp nhất.
+ Keo nano bạc có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao, do năng lượng bề mặt hạt nano lớn, nên các hạt nano bạc sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano làm tăng kích thước hạt nano gây hiện tượng keo tụ.
Vì vậy, chúng ta cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều để tăng khả năng diệt khuẩn và đồng thời tránh hiện tượng keo tụ.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
Lá sả chanh được thu hái tại phường An Sơn, thành phố Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam.
2.1.1. Thu nguyên liệu
Nguyên liệu được chọn mẫu lá sả già tươi, lấy phần thân của lá sả (phần màu trắng phình ra phía trên rễ), không bị dập nát, bảo quản nơi khô ráo. Nguyên liệu được thu hái sau khi trồng được 10 -12 tháng.
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Sau khi chọn được mẫu lá sả chanh, dùng nước cất rửa sạch lá sả và dùng dao cắt nhỏ lá sả.
Hình 2.1.Thân sả chanh đã làm sạch Hình 2.2.Mẫu sảđã cắt nhỏ
2.2. HÓA CHẤT
- Giấy lọc - HNO3đặc
- AgNO3 (bạc nitrat): PA, Trung Quốc. - NaOH (natri hyđroxyt): PA, Trung Quốc. - Nước cất 2 lần
2.3. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 2.3.1. Dụng cụ - Bình định mức 50ml, 1000ml - Bình cầu - Bình tam giác có nắp - Bếp điện - Cân phân tích có độ chính xác đến 0,001g - Cốc nung thạnh anh hoặc sứ - Ống đong, pipet, cốc, phễu - Ống nghiệm - Lò nung - Nhiệt kế - Phim và giấy lọc - Tủ sấy có nhiệt kếđảm bảo nhiệt độ 105 ÷ 1100C 2.3.2. Thiết bị
- Máy khuấy từ (Trung Quốc) (Phòng Hóa lý, ĐHSP Đà Nẵng) - Máy đo pH để bàn (Phòng Phân tích mẫu, ĐHSP Đà Nẵng)
- Máy quang phổ UV-Vis (Phòng phân tích nguyên tố, ĐHSP Đà Nẵng) - Máy chụp TEM (Phòng thí nghiệm hiển vi điện tử, Viện vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội)
- Máy chụp FE-SEM (Phòng thí nghiệm, Viện khoa học vật liệu, Hà Nội)
- Máy đo phổ FT- IR(Viện Hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam)
- Máy chụp EDX (Phòng thí nghiệm, Viện khoa học vật liệu, Hà Nội) - Máy chụp XRD (Phòng thí nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Hà Nội)
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu
Theo nguyên tắc:sử dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi
Tiến hành thí nghiệm
- Cân khối lượng của cốc và nắp, sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân mo(g).
- Cho mẫu lá sả cắt nhỏ vào cốc khoảng 5g, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g).
- Đặt cốc đựng mẫu vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g)
Kết quả tính độẩm (W)
Độẩm W của mẫu tính bằng phần trăm(%), theo công thức sau
Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi(g) m1:Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)
2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro
Theo nguyên tắc: Tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng.
Tiến hành thí nghiệm
- Rửa sạch cốc nung bằng nước, sấy trong tủ sấy ở 1050C trong 30 phút nung trong lò nung ở 525 ± 250C trong 30 phút. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001g. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
- Cân khoảng 5g mẫu với độ chính xác 0,001g trong cốc nung đã chuẩn bị.Sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C đến khô (khoảng 2 – 3 h).
- Đốt cẩn thận trên bếp điện đến than hoá.
- Nung ở nhiệt độ 525 ± 250C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà. - Làm guội trong bình hút ẩm. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
Tính kết quả
- Hàm lượng tro (X) tính bằng % theo công thức:
Trong đó:
m: lượng mẫu cân, g
m1: khối lượng cốc nung, g
2.4.3. Nghiên cứu điều kiện tạo dịch chiết nước lá sả
a.Chiết tách tinh dầu sả bằng phương pháp chiết soxhlet
Tiến hành thí nghiệm
Cân 50g nguyên liệu lá sả cắt nhỏ cho vào bình cầu cho thêm
etanol đến 2/3 bình cầu. Lắp dụng cụ chưng cất tinh dầu, đun trong khoảng 3 giờđến khi lượng tinh dầu không tăng được nữa thì kết thúc quá trình chưng cất, lấy thể tích tinh dầu.
Hình 2.3. Hệ thống chiết tách bằng phương pháp chiết soxhlet
- Tinh dầu sau khi chiết tách bằng phương pháp soxhlet đem đo phổ hồng ngoại (IR) nhằm xác định các nhóm chức có trong tinh dầu sả chanh
b. Chuẩn bị dịch chiết lá sả
Lá sả được rửa kỹ bằng nước cất. Tiếp theo, cắt lá sả ra thành miếng nhỏ. Cân khoảng m(g) lá sả đã được cắt nhỏ cho vào cốc thủy tinh, thêm vào cốc thủy tinh V(ml) nước cất. Sau đó, trộn hỗn hợp trên và đun sôi khoảng t(phút). Dịch chiết lá sả thu được bằng cách lọc hỗn hợp đã được đun sôi qua giấy lọc.
c.Tổng hợp dung dịch keo nano bạc
Dịch chiết lá sả trộn với dung dịch AgNO3 1mM theo tỉ lệ trong bình nón. Sau đó, điều chỉnh pH của dung dịch bằng dung dịch NaOH 0,1N. Bình nón chứa dung dịch trên được ủở nhiệt độ t0C khoảng thời gian t(phút). Quan sát sự thay đổi màu của dung dịch.
Dựa theo qui trình trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu điều kiện tạo dịch chiết nước lá sả, tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc.
Tiến hành thí nghiệm
Để nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo dịch chiết lá sả, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố đó là thời gian chiết. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm như sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian chiết
Cân 50g lá sả, chưng ninh với 200ml nước cất 2 lần, chiết trong khoảng thời gian biến thiên t = 5, 10, 15,20,25,30 phút. Lọc lấy dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết ứng với thời gian chiết cho vào mỗi bình tam giác, sau đó cho tiếp 20 ml dung dịch AgNO3 1mM, khấy đềubằng máy khấy từ, để thời gian tạo nano bạc khoảng 24h. Sau đó, đem dung dịch chứa hạt nano bạc vừa tạo ra pha loãng 10 lần rồi đo UV-Vis. Chọn thời gian chiết tối ưu ứng với giá trị mật độ quang cao nhất.
Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
Sau khi chọn được thời gian chiết tối ưu dựa vào phổ UV-Vis.Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo thay đổi tỉ lệ khối lượng lá sả/nước, các yếu tố khác cốđịnh.
- Đối với thông số tỉ lệ rắn lỏng, cốđịnh thể tích nước cất
VH2O = 200ml; các giá trị khối lượng lá sả biến thiên: m = 10g; 20g; 30g; 40g; 50g; 60g; 70g; 80g.
- Cách tiến hành tương tự như thí nghiệm 1, sau khi thu được keo nano bạc pha loãng 10 lần rồi đo phổ UV- Vis. Chọn tỉ lệ rắn / lỏng tối ưu ứng với giá trị mật độ quang cao nhất.
2.4.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
nano bạc
- Ảnh hưởng giữa tỉ lệ dịch chiết lá sả/dung dịch AgNO3
- Ảnh hưởng của giá trị pH - Ảnh hưởng của nhiệt độ - Ảnh hưởng của thời gian
2.5. NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA HẠT NANO BẠC
*Máy quang phổ truyền qua UV - Vis
Sử dụng máy quang phổ truyền qua UV – Vis tại Phòng thí nghiệm phân tích nguyên tố - Đại học sư phạm Đà Nẵng đểđánh giá và khảo sát chất lượng dung dịch keo nano Ag chế tạo được.
* Thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (INSTRUMENT JEM –
1400, VOLT 100 - Nhật) tại phòng thí nghiệm hiển vi điện tử - Viện vệ sinh dịch tễ, số 01 Yersin, Hà Nội đểđánh giá kích thước, hình dạng hạt nano Ag.
* Thiết bị kính hiển vi điện tử quét (FE - SEM)
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét FE – SEM (S4800, Hitachi - Nhật) tại Phòng thí nghiệm thuộc Viện khoa học vật liệu, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội đểđánh giá bề mặt các hạt nano Ag.
*Thiết bị chụp X-Ray
Sử dụng máy nhiễu xạ tia X( X-Ray) tại phòng thí nghiệm thuộc trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, số 19 Lê Thánh Tông, Hoàn Kiếm, Hà Nội để khẳng định hạt tạo thành là nano bạc.
* Thiết bị chụp EXD
2.6. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA KEO NANO BẠC
Hoạt tính kháng vi khuẩn, nấm của nano bạc được thực hiện dựa trên phương pháp thử nghiệm IP HCM V04: 2005. Đây là phương pháp thử nghiệm khả năng diệt vi khuẩn và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu nano bạc tổng hợp được.
* Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định. - Staphylococcus aureus: Cầu khuẩn gram (+)
- Escherichia coli: Vi khuẩn gram (-) - Salmonella Typhi: Vi khuẩn gram (-) - Aspergillus niger: Nấm mốc
- Candida albicans: Nấm men
* Môi trường nuôi cấy:Baird Parker, hektoen cho vi khuẩn
Thành phần các môi trường nuôi cấy vi khuẩn được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1.Thành phần các chất trong môi trường hektoen STT
Hóa chất Hàm
lượng STT Hóa chất
Hàm lượng
1 Peptone proteoza 12g 7 Salixin 2g
2 Bột cao men 3g 8 Muối mật 9g
3 Lactoza 12g 9 Natriclorua 5g
4 Xacaroza 12g 10 Na2S2O4.5H2O 5g
5 Amoni sắt (II) xitrat 1,5g 11 Thạch 12g
Cách pha chế môi trường:
Hòa các thành phần trên vào trong nước, ngâm khoảng 10 phút. Đun nhẹ, để sôi trong vài giây cho đến khi thạch tan. Điều chỉnh pH = 7,5 ở nhiệt độ 250C. Phân phối môi trường này theo từng lượng 15ml vào các ống nghiệm và đểđông lại.
Bảng 2.2. Thành phần các chất trong môi trường Baird Parker
STT Hóa chất Hàm lượng STT Hóa chất Hàm lượng 1 Cao thịt 1g 4 Na-Hyppurat 5g 2 Glucoza 12g 5 Nước cất 1000ml 3 NaH2PO4 5g 6 Pepton tuỵ tạng 10g
Cách pha chế môi trường:
- Hòa các thành phần trên vào trong nước, ngâm khoảng 10 phút. Đun nhẹ, để sôi trong vài giây cho đến khi thạch tan. Điều chỉnh pH = 7,5 ở nhiệt độ 250C.Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 30phút.
Thuốcthử:
H2SO4đặc: 50 ml Nước cất: 50 ml
Đổ từ từ H2SO4đặc vào nước cất
- Phản ứng xét nghiệm: trộn 1 ml dịch nuôi cấy với 1,5 ml thuốc thử. Phản ứng là dương tính khi xuất hiện tinh thể (do Hyppyrat được chuyển hoá thành Benzoin); không xuất hiện tinh thể là âm tính.
2.6.1. Tiến hành thử nghiệm keo nano bạc đối với vi khuẩn* Phương pháp thử: * Phương pháp thử:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu keo nano bạc với nồng độ 5µg/ml
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn với nồng độ 8,9.106÷ 9,1.106 (CFU/ml) Bước 3: Tiến hành thử nghiệm
- Các ống nghiệm được phân phối môi trường nuôi cấy vi khuẩn hàm lượng 15ml.Để nghiên cứu khả năng diệt vi khuẩn, người tatiến hành như sau: - Đưa vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch E. coli(8,9.106 CFU/ml); 1ml dung dịch S.Typhi(9,1. 106 CFU/ml); 1ml dung dịch S. Aureas(4,9.106 CFU/ml)
- Cho lần lượt vào mỗi ống nghiệmdung dịch nano bạc với nồng độ hạt nano 5 µg/ml. Sau đó, các ống nghiệm được nuôi cấy 48 giờ, ở nhiệt độ 37 ◦C
2.6.2. Tiến hành thử nghiệm keo nano bạc đối với nấm * Phương pháp thử: * Phương pháp thử:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu keo nano bạc với nồng độ 5µg/ml
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch nấm với nồng độ 5,9.105 đến 9.105 (CFU/ml) Bước 3: Tiến hành thử nghiệm
- Các ống nghiệm được phân phối môi trường nuôi cấy nấm hàm lượng 15ml. Để nghiên cứu khả năng diệt nấm, người ta tiến hành như sau:
- Đưa vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch dịch nấm A. Niger