M Ở ĐẦU
2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
6. Tổng quan tài liệu
2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu
Theo nguyên tắc:sử dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi
Tiến hành thí nghiệm
- Cân khối lượng của cốc và nắp, sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân mo(g).
- Cho mẫu lá sả cắt nhỏ vào cốc khoảng 5g, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g).
- Đặt cốc đựng mẫu vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g)
Kết quả tính độẩm (W)
Độẩm W của mẫu tính bằng phần trăm(%), theo công thức sau
Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi(g) m1:Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)
2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro
Theo nguyên tắc: Tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng.
Tiến hành thí nghiệm
- Rửa sạch cốc nung bằng nước, sấy trong tủ sấy ở 1050C trong 30 phút nung trong lò nung ở 525 ± 250C trong 30 phút. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001g. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
- Cân khoảng 5g mẫu với độ chính xác 0,001g trong cốc nung đã chuẩn bị.Sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C đến khô (khoảng 2 – 3 h).
- Đốt cẩn thận trên bếp điện đến than hoá.
- Nung ở nhiệt độ 525 ± 250C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà. - Làm guội trong bình hút ẩm. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
Tính kết quả
- Hàm lượng tro (X) tính bằng % theo công thức:
Trong đó:
m: lượng mẫu cân, g
m1: khối lượng cốc nung, g
2.4.3. Nghiên cứu điều kiện tạo dịch chiết nước lá sả
a.Chiết tách tinh dầu sả bằng phương pháp chiết soxhlet
Tiến hành thí nghiệm
Cân 50g nguyên liệu lá sả cắt nhỏ cho vào bình cầu cho thêm
etanol đến 2/3 bình cầu. Lắp dụng cụ chưng cất tinh dầu, đun trong khoảng 3 giờđến khi lượng tinh dầu không tăng được nữa thì kết thúc quá trình chưng cất, lấy thể tích tinh dầu.
Hình 2.3. Hệ thống chiết tách bằng phương pháp chiết soxhlet
- Tinh dầu sau khi chiết tách bằng phương pháp soxhlet đem đo phổ hồng ngoại (IR) nhằm xác định các nhóm chức có trong tinh dầu sả chanh
b. Chuẩn bị dịch chiết lá sả
Lá sả được rửa kỹ bằng nước cất. Tiếp theo, cắt lá sả ra thành miếng nhỏ. Cân khoảng m(g) lá sả đã được cắt nhỏ cho vào cốc thủy tinh, thêm vào cốc thủy tinh V(ml) nước cất. Sau đó, trộn hỗn hợp trên và đun sôi khoảng t(phút). Dịch chiết lá sả thu được bằng cách lọc hỗn hợp đã được đun sôi qua giấy lọc.
c.Tổng hợp dung dịch keo nano bạc
Dịch chiết lá sả trộn với dung dịch AgNO3 1mM theo tỉ lệ trong bình nón. Sau đó, điều chỉnh pH của dung dịch bằng dung dịch NaOH 0,1N. Bình nón chứa dung dịch trên được ủở nhiệt độ t0C khoảng thời gian t(phút). Quan sát sự thay đổi màu của dung dịch.
Dựa theo qui trình trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu điều kiện tạo dịch chiết nước lá sả, tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc.
Tiến hành thí nghiệm
Để nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo dịch chiết lá sả, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố đó là thời gian chiết. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm như sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian chiết
Cân 50g lá sả, chưng ninh với 200ml nước cất 2 lần, chiết trong khoảng thời gian biến thiên t = 5, 10, 15,20,25,30 phút. Lọc lấy dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết ứng với thời gian chiết cho vào mỗi bình tam giác, sau đó cho tiếp 20 ml dung dịch AgNO3 1mM, khấy đềubằng máy khấy từ, để thời gian tạo nano bạc khoảng 24h. Sau đó, đem dung dịch chứa hạt nano bạc vừa tạo ra pha loãng 10 lần rồi đo UV-Vis. Chọn thời gian chiết tối ưu ứng với giá trị mật độ quang cao nhất.
Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
Sau khi chọn được thời gian chiết tối ưu dựa vào phổ UV-Vis.Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo thay đổi tỉ lệ khối lượng lá sả/nước, các yếu tố khác cốđịnh.
- Đối với thông số tỉ lệ rắn lỏng, cốđịnh thể tích nước cất
VH2O = 200ml; các giá trị khối lượng lá sả biến thiên: m = 10g; 20g; 30g; 40g; 50g; 60g; 70g; 80g.
- Cách tiến hành tương tự như thí nghiệm 1, sau khi thu được keo nano bạc pha loãng 10 lần rồi đo phổ UV- Vis. Chọn tỉ lệ rắn / lỏng tối ưu ứng với giá trị mật độ quang cao nhất.
2.4.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
nano bạc
- Ảnh hưởng giữa tỉ lệ dịch chiết lá sả/dung dịch AgNO3
- Ảnh hưởng của giá trị pH - Ảnh hưởng của nhiệt độ - Ảnh hưởng của thời gian
2.5. NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA HẠT NANO BẠC
*Máy quang phổ truyền qua UV - Vis
Sử dụng máy quang phổ truyền qua UV – Vis tại Phòng thí nghiệm phân tích nguyên tố - Đại học sư phạm Đà Nẵng đểđánh giá và khảo sát chất lượng dung dịch keo nano Ag chế tạo được.
* Thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (INSTRUMENT JEM –
1400, VOLT 100 - Nhật) tại phòng thí nghiệm hiển vi điện tử - Viện vệ sinh dịch tễ, số 01 Yersin, Hà Nội đểđánh giá kích thước, hình dạng hạt nano Ag.
* Thiết bị kính hiển vi điện tử quét (FE - SEM)
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét FE – SEM (S4800, Hitachi - Nhật) tại Phòng thí nghiệm thuộc Viện khoa học vật liệu, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội đểđánh giá bề mặt các hạt nano Ag.
*Thiết bị chụp X-Ray
Sử dụng máy nhiễu xạ tia X( X-Ray) tại phòng thí nghiệm thuộc trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, số 19 Lê Thánh Tông, Hoàn Kiếm, Hà Nội để khẳng định hạt tạo thành là nano bạc.
* Thiết bị chụp EXD
2.6. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA KEO NANO BẠC
Hoạt tính kháng vi khuẩn, nấm của nano bạc được thực hiện dựa trên phương pháp thử nghiệm IP HCM V04: 2005. Đây là phương pháp thử nghiệm khả năng diệt vi khuẩn và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu nano bạc tổng hợp được.
* Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định. - Staphylococcus aureus: Cầu khuẩn gram (+)
- Escherichia coli: Vi khuẩn gram (-) - Salmonella Typhi: Vi khuẩn gram (-) - Aspergillus niger: Nấm mốc
- Candida albicans: Nấm men
* Môi trường nuôi cấy:Baird Parker, hektoen cho vi khuẩn
Thành phần các môi trường nuôi cấy vi khuẩn được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1.Thành phần các chất trong môi trường hektoen STT
Hóa chất Hàm
lượng STT Hóa chất
Hàm lượng
1 Peptone proteoza 12g 7 Salixin 2g
2 Bột cao men 3g 8 Muối mật 9g
3 Lactoza 12g 9 Natriclorua 5g
4 Xacaroza 12g 10 Na2S2O4.5H2O 5g
5 Amoni sắt (II) xitrat 1,5g 11 Thạch 12g
Cách pha chế môi trường:
Hòa các thành phần trên vào trong nước, ngâm khoảng 10 phút. Đun nhẹ, để sôi trong vài giây cho đến khi thạch tan. Điều chỉnh pH = 7,5 ở nhiệt độ 250C. Phân phối môi trường này theo từng lượng 15ml vào các ống nghiệm và đểđông lại.
Bảng 2.2. Thành phần các chất trong môi trường Baird Parker
STT Hóa chất Hàm lượng STT Hóa chất Hàm lượng 1 Cao thịt 1g 4 Na-Hyppurat 5g 2 Glucoza 12g 5 Nước cất 1000ml 3 NaH2PO4 5g 6 Pepton tuỵ tạng 10g
Cách pha chế môi trường:
- Hòa các thành phần trên vào trong nước, ngâm khoảng 10 phút. Đun nhẹ, để sôi trong vài giây cho đến khi thạch tan. Điều chỉnh pH = 7,5 ở nhiệt độ 250C.Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 30phút.
Thuốcthử:
H2SO4đặc: 50 ml Nước cất: 50 ml
Đổ từ từ H2SO4đặc vào nước cất
- Phản ứng xét nghiệm: trộn 1 ml dịch nuôi cấy với 1,5 ml thuốc thử. Phản ứng là dương tính khi xuất hiện tinh thể (do Hyppyrat được chuyển hoá thành Benzoin); không xuất hiện tinh thể là âm tính.
2.6.1. Tiến hành thử nghiệm keo nano bạc đối với vi khuẩn* Phương pháp thử: * Phương pháp thử:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu keo nano bạc với nồng độ 5µg/ml
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn với nồng độ 8,9.106÷ 9,1.106 (CFU/ml) Bước 3: Tiến hành thử nghiệm
- Các ống nghiệm được phân phối môi trường nuôi cấy vi khuẩn hàm lượng 15ml.Để nghiên cứu khả năng diệt vi khuẩn, người tatiến hành như sau: - Đưa vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch E. coli(8,9.106 CFU/ml); 1ml dung dịch S.Typhi(9,1. 106 CFU/ml); 1ml dung dịch S. Aureas(4,9.106 CFU/ml)
- Cho lần lượt vào mỗi ống nghiệmdung dịch nano bạc với nồng độ hạt nano 5 µg/ml. Sau đó, các ống nghiệm được nuôi cấy 48 giờ, ở nhiệt độ 37 ◦C
2.6.2. Tiến hành thử nghiệm keo nano bạc đối với nấm * Phương pháp thử: * Phương pháp thử:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu keo nano bạc với nồng độ 5µg/ml
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch nấm với nồng độ 5,9.105 đến 9.105 (CFU/ml) Bước 3: Tiến hành thử nghiệm
- Các ống nghiệm được phân phối môi trường nuôi cấy nấm hàm lượng 15ml. Để nghiên cứu khả năng diệt nấm, người ta tiến hành như sau:
- Đưa vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch dịch nấm A. Niger ( 5,9.105CFU/ml); Nấm C. albicans (9,0.105 CFU/ml)
- Cho lần lượt vào mỗi ống nghiệm dung dịch keo nano bạc với nồng độ5 µg/ml. Sau đó, các ống nghiệm được nuôi cấy 120 giờ, ở nhiệt độ 37 ◦C
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ
3.1.1. Xác định độ ẩm ban đầu của mẫu
Độ ẩm của nguyên liệu mẫu lá sảđược xác định và trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết quả xác định độẩm trong lá sả STT m0(g) m1(g) m2(g) Độẩm W(%) (%) 1 25,681 30,681 26,307 87,48 2 28,118 33,118 28,747 87,42 3 32,588 37,588 33,207 87,62 4 28,707 33,707 29,327 87,60 5 31,166 36,116 31,791 87,50 87,52
Nhận xét: Độ ẩm trung bình trong mẫu lá sả tươi là = 87,52%. Với kết quảđộẩm của lá sả, chúng tôi không bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài mà thu hái mẫu lá sả già tươi và xử lý mẫu lá sả cho từng buổi thí nghiệm.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro
Hàm lượng tro của mẫu lá sảđược xác định và trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng tro trong mẫu lá sả
STT m(g) m1(g) m2(g) Hàm lượng tro X(%) (%) 1 5,000 25,681 25,880 3,98 2 5,000 28,118 28,281 3,26 3 5,000 32,588 32,776 3,76 4 5,000 28,707 28,897 3,80 5 5,000 31,166 31,306 2,80 3,52
Nhận xét:Hàm lượng tro trung bình trong mẫu lá sả rất thấp, chiếm khoảng 3,52% khối lượng lá sả.
3.2.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TẠO DỊCH CHIẾT NƯỚC
LÁ SẢ
3.2.1. Kết quả đo phổ IR của tinh dầu sả
Tiến hành thu tinh dầu sả trong thiết bị chiết. Lấy phần tinh dầu thu được, đem đo phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier tại Viện Hóa học – Viện công nghệ Việt Nam. Kết quảđo phổ FT-IR ở hình 3.1.
Hình 3.1.Phổ FT-IR của tinh dầu sả
Nhận xét: Dựa vào kết quả phổ FT- IR của tinh dầu sả ta thấy xuất hiện các đỉnh hấp thu như sau:
Pic: 3464 cm-1: dao động hóa trị của nhóm –OH Pic: 1640 cm-1: dao động hóa trị của nhóm C = O
Pic: 1388 cm-1: dao động biến dạng của nhóm –OH
Như vậy, trong tinh dầu sả có chứa các nhóm chức hyđroxy( -OH), nhóm cacbonyl (C = O).
Sau khi xác định các nhóm chức có trong dịch chiết nước sả chanh. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng các thông số như thời gian chiết, tỉ lệ lá sả/nước, để tìm điều kiện tối ưu tạo dịch chiết lá sả.
Hình 3.2. Đun sôi hỗn hợp lá sả/nước Hình 3.3. Mẫu dịch chiết nước lá sả
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết
Để khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo dịch chiết lá sả tối ưu(nghĩa là tạo ra dịch chiết có khả năng tổng hợp lượng nano bạc tốt nhất) vào thời gian chiết, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các thông số như sau:
- Tỉ lệ rắn/lỏng: 80gam/200ml nước cất - Nồng độ dung dịch AgNO3: 1mM
- Tỉ lệ dịch chiết/dung dịch AgNO3: 1:4 (5ml dịch chiết/ 20ml dd AgNO31mM)
- Nhiệt độ tạo nano bạc: nhiệt độ phòng - Thời gian tạo nano bạc: 24 giờ
Đối với thông số thời gian chiết, các giá trị biến thiên: t = 5 phút, 15phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút.
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo dịch chiết lá sả tối ưu vào thời gian chiết được biểu diễn ở bảng 3.3, hình 3.4, hình 3.5.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thời gian chiết
Hình 3.4. Phổ UV-Vis mẫu nano bạc khảo sát thời gian chiết ởđiều kiện nhiệt độ phòng, t = 24h ; pH = 8
Thời gian chiết Mật độ quang (Abs) 5 phút 0,058697 15 phút 0,13996 20 phút 0,15949 25 phút 0,17986 30 phút 0,17645
Hình 3.5. Sự thay đổi màu sắc trong quá trình tạo nano bạc khi khảo sát thời gian chiết ởđiều kiện nhiệt độ phòng, t = 24h ; pH = 8
Nhận xét:
Từ kết quả của hình 3.4và bảng 3.3 của các mẫu nano bạc cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 5 ÷25 phút thì mật độ quang tăng lên và đạt giá trị mật độ quang cao nhất ở 25 phút.Nếu tiếp tục tăng thời gian 30phút chưng ninh thì mật độ quang giảm. Điều này được giải thích là ở thời gian chưng ninh 25 phút tạo ra một complex lượng chất khử thích hợp nhất để khử lượng ion bạc lớn nhất tạo hạt nano bạc. Khi tăng thời gian chiết có thể tách ra nhiều hợp chất không có lợi cho quá trình tạo nano bạc hoặc tạo ra lượng chất khử nhiều làm cho quá trình tạo nano bạc xảy ra nhanh, các hạt nano bạc tạo thành chuyển động nhanh, va chạm mạnh tạo thành hạt có kích thước lớn hơn gây
hiện tượng keo tụ và làm giảm số lượng hạt ở kích thước nano làm giảm mật độ quang.Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian chiết tối ưu 25 phút.
3.2.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng
Để khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo dịch chiết lá sả tối ưu phụ thuộc vào tỉ lệ khối lượng lá sả so với thể tích nước, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các thông số sau:
- Đối với thông số tỉ lệ rắn/lỏng, cố định thể tích nước V= 200ml, các giá trị khối lượng lá sả biến thiên như sau: m = 10 gam, 20 gam, 30 gam, 40gam, 50 gam,60 gam, 70 gam, 80gam.
- Các thông số khác cốđịnh như mục 3.2.1. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo dịch chiết lá sả tối ưu vào tỉ lệ rắn / lỏng được biểu diễn ở bảng 3.4, hình 3.6, hình 3.7 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn –lỏng Khối lượng lá sả(g)/VH2O Mật độ quang (Abs) 10g/200ml 0.18237 20g/200ml 0.25383 30g/200ml 0.20630 40g/200ml 0.20672 50g/200ml 0.25761 60g/200ml 0.19164 70g/200ml 0.14018 80g/200ml 0.08528