6. Cấu trúc luận văn
2.1.DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1.1. Dụng cụ
- Bình cầu 25ml, bình cầu 15ml, phễu chiết, phễu lọc. - Các pipet loại 5ml và 1ml.
- Nhiệt kế, ống sinh hàn, giấy lọc. - Cốc thủy tinh 100ml, 500ml. - Ống sealed tube
- Một số dụng cụ thủy tinh khác
2.1.2. Thiết bị
- Máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, máy sóng siêu âm. - Cân phân tích.
- Máy khối phổ HP 5989B MS Engine, LC/MSD Agilent; máy Bruker Avance–500 MHz; máy quang phổ IMPACT410 của hãng Nicolet, Hoa Kì.
- Đèn tử ngoại bước sóng λ= 254nm.
2.1.3. Hóa chất
- 4-nitroaniline
- 4-methoxybenzylamine - 4-nitrophenylazide
- Acetophenone, 2-methylacetophenone, 4-nitroacetophenone - Acid acetic
- Ethanol, toluene
- Dichloromethane; heptane; ethylacetate - Bản mỏng silicagel 60GF254 độ dày 0,2mm; - Silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck.
- Các hóa chất sử dụng có mức độ tinh khiết đạt chuẩn của hãng Merck.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất 1,2,3-triazole thế vị trí 1,5 2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất 1,2,3-triazole thế vị trí 1,5
a. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole
acetophenone , 4-methoxybenzylamine, 4-nitrophenyl azide (Hình 2.1).
Hình 2.1. Phản ứng tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole
Tiến hành phản ứng: Hỗn hợp các chất gồm acetophenone (150mg, 1.26 mmol), 4-methoxybenzylamine (240mg, 1.74 mmol), 4-nitrophenyl azide (204 mg, 1.26
mmol), 4 Å molecular sieves (100 mg), xúc tác CH3COOH (1-2 giọt) và 1.2mL dung
môi toluen được cho vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy từ ở 1000C
trong thời gian 12 giờ. Tiến trình phản ứng được kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm được tinh chế trực tiếp bằng sắc ký cột với dung môi CH2Cl2 để loại bỏ tất cả 4- nitroaniline hình thành trong suốt phản ứng. Sau đó sử dụng hệ dung môi rửa giải heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4 để thu được sản phẩm tinh khiết [14].
Quy trình phản ứng:
Hình 2.2. Quy trình tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole
Chất phản ứng: acetophenone;
4-methoxybenzylamine; 4-nitrophenyl azide; Xúc tác: acid acetic
Dung môi: toluene 4 Å MS
Khuấy, gia nhiệt ở 1000 C Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng,
Sản phẩm tinh khiết
Xác định cấu trúc Chạy sắc kí cột
b. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole
Dẫn xuất 1-(4-methoxybenzyl)-5-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole được
tổng hợp từ 4-nitroacetophenone, 4-methoxybenzylamine, 4-nitrophenyl azide
(Hình 2.3).
Hình 2.3. Phản ứng tổng hợp
1-(4-methoxybenzyl)-5-(4- nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole
Tiến hành phản ứng: Hỗn hợp gồm các chất 4-nitroacetophenone (207mg, 1,26mmol), 4-methoxybenzylamine (240mg, 1.74 mmol), 4-nitrophenyl azide (204 mg, 1.26 mmol), 4 Å molecular sieves (100 mg), xúc tác CH3COOH (1- 2 giọt) và 1.2mL dung môi toluen được cho vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng
được khuấy từ ở 1000C trong thời gian 12 giờ. Tiến trình phản ứng được kiểm tra
bằng sắc kí bản mỏng trong hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm được tinh chế trực tiếp bằng sắc ký cột với dung môi CH2Cl2 để loại bỏ tất cả 4-nitroaniline hình thành trong suốt phản ứng. Sau đó sử dụng hệ dung môi rửa giải heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4 để thu được sản phẩm tinh khiết [14].
Quy trình phản ứng:
Hình 2.4. Quy trình tổng hợp
1-(4-methoxybenzyl)-5-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole
c. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-(p-tolyl)-1H-1,2,3-triazole
Dẫn xuất 1-(4-methoxybenzyl)-5-(p-tolyl)-1H-1,2,3-triazole được tổng hợp từ
4-methylacetophenone, 4-methoxybenzylamine, 4-nitrophenyl azide (Hình 2.5).
Hình 2.5. Phản ứng tổng hợp1-(4-methoxybenzyl)-5-(p-tolyl)-1H-1,2,3-triazole
Chất phản ứng: 4-nitroacetophenone; 4-methoxybenzylamine;4-nitrophenyl azide; Xúc tác: acid acetic
Dung môi: toluene 4 Å MS
Khuấy, gia nhiệt ở 1000 C Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng,
Sản phẩm tinh khiết
Xác định cấu trúc Chạy sắc kí cột
Tiến hành phản ứng: Hỗn hợp gồm các chất 4-methylacetophenone (168mg, 1,26mmol), 4-methoxybenzylamine (240mg, 1.74 mmol), 4-nitrophenyl azide (204
mg, 1.26 mmol), 4 Å molecular sieves (100 mg), xúc tác CH3COOH (1- 2 giọt) và
1.2mL dung môi toluen được cho vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy
từ ở 1000C trong thời gian 12 giờ. Tiến trình phản ứng được kiểm tra bằng sắc kí bản
mỏng trong hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn
hợp sản phẩm được tinh chế trực tiếp bằng sắc ký cột với dung môi là CH2Cl2 để loại
bỏ tất cả 4-nitroaniline hình thành trong suốt phản ứng. Sau đó sử dụng hệ dung môi rửa giải heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4 để thu được sản phẩm tinh khiết [14].
Quy trình phản ứng:
Hình 2.6. Quy trình tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-(p-tolyl)-1H-1,2,3-triazole
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Hỗn hợp các chất sau phản ứng được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc
kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với dung môi chạy cột đầu tiên là CH2Cl2 để loại
bỏ tất cả 4-nitroanilin tạo thành trong quá trình phản ứng. Sau đó sử dụng hệ dung môi rửa giải heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4 để thu được sản phẩm tinh khiết. Sắc kí cột sử dụng sắc kí cột thường, pha tĩnh là silicagel. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất
Chất phản ứng: 4-nitroacetophenone; 4-methoxybenzylamine; 4-nitrophenyl azide; Xúc tác: acid acetic
Dung môi: toluene 4 A0 MS
Khuấy, gia nhiệt ở 1000 C Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng,
Sản phẩm tinh khiết
Xác định cấu trúc Chạy sắc kí cột
cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.
a. Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho dung môi CH2Cl2 vào ca nhựa.
- Cân lượng silicagel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) cần thiết cho vào ca nhựa trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Silicagel được cho vào cột ở dạng sệt. Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột).
- Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Ổn định cột bằng cách đổ dung môi liên tục vào cột khoảng 30 – 60 phút đến khi vạch silicagel không xuống nữa [1].
b. Nạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp ướt.
- Hòa tan hoàn tan mẫu trong một lượng tối thiểu dung môi chạy cột ban đầu là CH2Cl2.
- Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này, chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều) [1].
c. Phương pháp rửa giải
Rửa giải liên tục bằng dung môi chạy cột đầu tiên là CH2Cl2. Sau khi loại bỏ
hết 4-nitroanilin thì thay hệ dung môi n-heptan/EtOAc tỉ lệ 6/4 để thu được sản phẩm tinh khiết. Thử sản phẩm tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và
2D-NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, COSY, HSQC, HMBC. Các loại phổ được đo
tại Phòng thí nghiệm tổng hợp Hóa Dược – Hà Nội.
a. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Chính vì vậy, việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức) và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong
các nhóm hydroxyl là 330-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-
1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020-1100 cm-1, của nhóm C=C trong
khoảng 1630-1650 cm-1, của nhóm N-H trong khoảng 3400-3500 cm-1, v.v…Đặt
biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận biết dạng
các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp. Hiện nay thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (nghiền và ép viên với KBr bằng máy ép thủy lực dưới áp suất thấp khoảng 13-15 atm) lại cần từ 2-3 mg và khó thu hồi lại. Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất tổng hợp (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân [2].
b. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion phân tử và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng. Bởi vì e là điện tích của một electron, được lấy là l, nên các ion có z>l là rất nhỏ, do đó tỷ số m/z thường chính là khối lượng của ion.
Vì thế phổ thu được có tên là phổ khối khối lượng viết tắt là phổ MS (Mass Spectroscopy).
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân chia mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác nhau mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
+ Phổ ESI-MS ( Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao [2].
c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói riêng và hợp chất thiên nhiên nói chung. Việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ
proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới
tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin-spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hóa học của các proton được xác định trong thanh ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.
Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 230 ppm).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều ( 2D-NMR)
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yesu thường được sử dung như sau:
+Phổ COSY
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
+ Phổ HMQC
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.
Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác
HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. + Phổ HMBC
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc [2].
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học
a. Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở người gồm Vi khuẩn: Gram (-):
- Pseudomonas aeruginosa (Pa) (ATCC 15442): trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Escherichia coli (Ec) (ATCC 25922):, gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Enterococcus faecium (Se): là vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.
Vi khuẩn: Gram (+):
- Bacillus subtilis (Bs) (ATCC 6633): là trực khuẩn Gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (Sa) (ATCC 13709): là cầu khuẩn Gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: (Lf): là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
Nấm:
- Candida albicans (Ca) (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa [9], [17].
b. Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm [9], [17].
c. Phương pháp thử nghiệm
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu thử thông qua các giá
trị thể hiện hoạt tính là MIC(nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%),
MBC(nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) [9], [17].
d. Pha loãng mẫu thử
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
- Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml được pha loãng thành dãy các nồng độ 256g/ml; 64g/ml, 16g/ml; 4g/ml; 1g/ml để thử hoạt tính với các chủng vi khuẩn và nấm [9], [17].
e. Thử hoạt tính
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến
hành thử.
- Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200
l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 370C. Sau 24 giờ, bổ sung 50 l MTT (1mg/ml)
vào các giếng thử và đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất không chuyển hoá MTT thành MTT