Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng được nhóm tác giả Navarro và cộng sự mô tả năm 1972 trên cây cam [15] và cải tiến bởi Su and Chu năm 1984 [18].
Quy trình vi ghép bao gồm chuẩn bị gốc ghép và đỉnh sinh trưởng. Gốc ghép, được nuôi trong điều kiện in vitro trên môi trường MS (Murashige and Skoog, 1972) [15] ở nhiệt độ 25°C cường độ ánh sáng 1000 lux trong 16 giờ sáng hàng ngày bằng đèn huỳnh quang. Đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi non từ cây cam bị nhiễm bệnh. Chồi vi ghép lần 1 sống được tiến hành vi ghép lần thứ hai. Các chồi vi ghép lần 1 sẽ được ghép lên gốc ghép (bưởi chua, chấp) trong nhà lưới. Sau khi vi ghép lần 2, cây được bao trùm túi nilon trắng khoảng 3 tuần. Cây ghép sống tiếp tục chuyển trồng vào chậu chăm sóc, đồng thời được kiểm định bệnh greening và tristeza trước khi đưa vào lưu giữ nguồn gen.
-Ưu điểm
+ Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi ghép đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
+ Tạo cây sạch bệnh
+ Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi ghép về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gene dị hợp hay đồng hợp.
+ Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
-Nhược điểm
+ Vi ghép đòi hỏi người thực hiện phải được đào tạo kỹ thuật thành thạo. + Yêu cầu trang bị kính hiển vi.
+ Các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
2.3.2. Nhân giống bằng phương pháp vi ghép cải tiến
Do những hạn chế của phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng là khó thao tác nên khó áp dụng trong thực tiễn vì vậy việc cải tiến kỹ thuật này để trở thành đơn giản hơn, dễ áp dụng hơn sẽ là một yêu cầu cần thiết trong thực tiễn. Dựa trên phương pháp ghép in vitro đỉnh sinh trưởng, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển kỹ thuật vi ghép cải tiến và ứng dụng trong tạo cây cam, quýt sạch bệnh.
- Quy trình của kỹ thuật này như sau:
Chuẩn bị mắt ghép: Chăm sóc cây cho mắt ghép (cam Bố Hạ) đến khi cây ra mắt ghép để thu mắt ghép. Trong giai đoạn này, cây cho mắt ghép chỉ được tưới nước, không bón phân. Thu mắt ghép khi cây đủ điều kiện cho mắt.
Chuẩn bị gốc ghép (bưởi Diễn): Rửa sạch hạt bưởi Diễn bằng nước sau khi loại bỏ vỏ cứng và vỏ lụa. Hạt được nuôi trong điều kiệm yếm khí, nhiệt độ 20-25°C, cường độ ánh sáng 2.000 – 2.500 lux đèn huỳnh quang, thời gian chiếu sáng có thể từ 6h – 24h/ngày với môi trường là khăn giấy được tẩm ướt. Theo dõi và chăm sóc cây gốc ghép cho đến khi được ghép. Lưu ý, chuẩn bị gốc ghép phải phù hợp với thời gian được thu mắt ghép.
Vi ghép cải tiến: Sau khi gốc ghép được 15 ngày, chồi ghép lên được 22 ngày, tiến hành phương pháp vi ghép cải tiến. Cây ghép được nuôi trong môi trường khăn giấy ẩm với điều kiệm yếm khí, cường độ ánh sáng 2.000 – 2.500 lux, nhiệt độ 20 - 25°C.
Chuyển cây vi ghép ra chậu đất: Khi cây vi ghép bật chồi được 30 ngày, tiến hành chuyển cây vi ghép ra chậu đất. Tiến hành chăm sóc đồng thời theo dõi và kiểm tra sự xuất hiện của bệnh greening và tristeza trước khi đưa đi bảo tồn nguồn gen.
- Ưu điểm:
+ Tạo ra giống cây sạch bệnh.
+ Không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại.
+ Không đòi hỏi trình độ chuyên môn, kỹ thuật cao. + Tiết kiệm không gian nuôi cây.
+ Quá trình vi ghép không cần thực hiện trong điều kiện vô trùng - Nhược điểm:
+ Yêu cầu tuổi của mầm ghép phải đủ ngày ghép. Nếu mắt ghép non quá thì mắt rất dễ bị chết, nếu mắt già quá thì khả năng mắt bị nhiễm bệnh cao
+ Phải chọn được mắt ghép có kích thước nhỏ để phù hợp với gốc ghép
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các dòng/giống Cam Bố Hạ, Bắc Giang gồm cam sành và cam chanh
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, trường Đại Học Nông Lâm – Đại Học Thái Nguyên
3.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu
3.1.3.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.1. Thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị
1 Bộ điện di
2 Máy lý tâm Centrifuge 5427 R
3 Bể ổn nhiệt Water Bath
4 Cân điện tử
5 Máy PCR Master cycler X50s
6 Máy đồng hóa mẫu Bead Bug 6
7 Máy Spindown
8 Máy Vortex Mixer
9 Bàn soi gel UVP Transilluminator
10 Lò vi sóng Microwave 11 Tủ lạnh 12 Tủ sấy 13 Máy đo PH 14 Micropipette 15 Khay ELISA 16 Máy khuấy từ 17 Máy lọc nước download by : skknchat@gmail.com
3.1.3.2. Hoá chất
Đề tài sử dụng các loại hóa chất của các hãng như trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hoá chất
1 Ethanol
2 Loading Dye
3 QG buffer
4 Tris base
5 Ethylenedisaminetetraacetic acid (EDTA)
6 Isopropanol
7 Acetic acid băng
8 Phenol 9 Chloroform 10 Isoamin alcohol 11 Sodium acetate 12 Lysis buffer 13 Ethydium bromide 14 Agarose 15 5X PCR Buffer 16 dNTPs (2,5 mM) 17 MgCl2 25 mM
18 Taq DNA Polymerase (5U/µl)
19 Nước PCR
20 DNA ladder
21 DNA loading dye
22 Kháng thể bắt giữ (Capture antibody)
23 Kháng thể cộng hợp (Conjugate antibody)
24 Mẫu kiểm chứng âm tính
STT Tên hoá chất
25 Mẫu kiểm chứng dương tính với virus tristeza
26 NaHCO3 27 NaCl 28 KH2PO4 29 Na2HPO4 30 KCl 31 MgCl2 32 Na2CO3 33 NaOH 34 Polyvinylpyrrolidone (PVP) 35 Tween 20 36 Dietanolammine
37 Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum
Albumin -BSA)
Bảng 3.3. Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh greening (Hung và cs, 2004) [14]
Tên mồi
GR-F GR-R
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép - Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép - Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép
- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép
- Nội dung 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép - Nội dung 7: Kiểm tra bệnh greening và tristeza cây vi ghép bằng kỹ thuật sinh học phân tử
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Các gốc ghép được sử dụng: Gốc chấp, gốc bưởi Diễn, gốc cam Hàm Yên. Các công thức được bố trí như sau:
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ cây vi ghép sống và tốc độ sinh trưởng của các cây vi ghép, định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.2. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Hạt sau khi bóc vỏ cứng và vỏ lụa, để trong môi trường nuôi cấy sẽ được bố trí theo 3 công thức như sau
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ hạt nảy mầm và tốc độ sinh trưởng của hạt bưởi Diễn, định kỳ 5 ngày/ lần
3.3.3. Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Gốc ghép được theo dõi từ khi bắt đầu gieo hạt. Thí nghiệm được bố trí theo 4 công thức như sau:
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ cây vi ghép sống và tốc độ sinh trưởng của các cây vi ghép, định kỳ 5 ngày/ lần
3.3.4. Ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép
Theo dõi mầm ghép ngoài vườn ươm từ khi bắt đầu bật chồi. Mắt ghét được lấy trực tiếp từ cây cam sành và cam chanh Bố Hạ. Chỉ dùng mắt thức (mắt đã nổi rõ), không lấy mắt ghép trên cành còn non (cành phải được 3 tháng tuổi trở lên)
Thí nghiệm được bố trí theo 4 công thức:
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mắt ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.5. Ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép
Nghiên cứu dựa trên 3 kỹ thuật ghép: Mối ghép bằng, mối ghép áp, mối ghép hình chữ V. Các kỹ thuật được bố trí theo các công thức như sau.
Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép
Cây ghép được để ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: không có ánh sáng, ánh sáng yếu, ánh sáng bức xạ. Các điều kiện chiếu sáng được bố trí theo các công thức sau.
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến hiệu quả vi ghép Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Thu thập mẫu lá cây vi ghép, tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Dolye và cộng sự năm 1987 với sự biến đổi nhỏ để phù hợp với phòng thí nghiệm. Các bước tách chiết DNA tổng số như sau:
-Cắt nhỏ mẫu lá, chuyển vào ống effendorf loại 2,0 ml sạch, vô trùng. - Bổ sung 1ml lysis buffer + 2 viên bi sắt, chuyển vào máy đồng hóa mẫu. Tiến hành đồng hóa mẫu với 6 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4.000 vòng/phút trong 30 giây để thu được dạng dung dịch.
- Ủ mẫu đã đồng hóa ở 65°C trong 1h, cứ 10 phút đảo trộn mạnh bằng máy vortex 1 lần.
- Ly tâm ở tốc độ 12.500 vòng/phút trong 10 phút, thu 600 µl dịch nổi sáng ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng.
- Bổ sung 600 µl dung dịch hỗn hợp phenol: clorofome: isoamin alcohol (theo tỷ lệ 25:24:1, v:v:v), lắc đều.
- Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi sang ống eppendorf loại 1,5 ml mới, vô trùng.
- Bổ sung 50µl dung dịch sodium acetate 5M (pH = 5,5) và 500 µl dung dịch isopropanol, đảo trộn nhẹ nhàng.
-Ủ mẫu ở -20°C trong vòng tối thiểu 2h hoặc qua đêm.
-Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. - Bổ sung 1.000µl cồn 70%, đảo trộn bằng máy vortex, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cồn 70%.
- Mở nắp effendorf để bay hơi hoàn toàn cồn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
-Bổ sung 200µl dung dịch đệm TE 1% đảo trộn nhẹ. Để DNA hòa tan tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc ủ ở 70oC nếu cần hòa tan nhanh.
-Kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
3.3.8. Phương pháp PCR để phát hiện cây bị bệnh greening
Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để phát hiện bệnh greening trên cây vi ghép. Thành phần của phản ứng PCR như sau:
- 5X PCR Buffer: - dNTPs (2,5 mM):
- Mồi G-R (10 µM): - DNA khuôn:
- Taq DNA Polymerase (5U/µl):0,2 µl - Nước PCR:
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
- Giai đoạn Biến tính ban đầu: 95°C trong 10 phút - Giai đoạn khuếch đại: 40 chu kỳ, gồm:
+ Biến tính DNA: + Gắn mồi:
+ Kéo dài mạch:
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: - Ủ và bảo quản:
Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2,0%
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose, mẫu bị bệnh greening được biểu hiện bằng sự xuất hiện của sản phẩm PCR có kích thước khoảng 226 bp. Mẫu không hình thành sản phẩm PCR được coi là mẫu không bị bệnh greening.
3.3.9. Phương pháp kiểm tra bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA Bước 1. Chuẩn bị mẫu: ELISA Bước 1. Chuẩn bị mẫu:
- Cân 2,0 g mẫu lá, chuyển vào ống Eppendorf 2ml mới
- Bổ sung 2 viên bi và 1200 µl dung dịch extraction buffer chuyển vào máy đồng hoá mẫu. Tiến hành đồng hoá mẫu với 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4000 vòng/phút trong 30 giây để thu dịch nổi đồng nhất
- Ly tâm mẫu với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút, ở nhiệt độ 10°C - Sử dụng micropipet hút chuyển phần dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml mới
- Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4°C để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo
Lưu ý: Chỉ chuẩn bị mẫu ngay trước khi tiến hành thực hiện phản ứng ELISA, không chuẩn bị mẫu trước quá 1 ngày.
Bước 2: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu
- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng
- Rửa khay 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet hút toàn bộ dung dịch trong các giếng.
Bước3: Bổ sung mẫu phân tích
- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ 2h - 4h ở 37oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 4: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme
- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 5: Thêm cơ chất
- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate (Merck) trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl cơ chất vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt thường (khoảng 1-3h).
Bước 6: Kiểm tra kết quả
Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngưng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50µl Natri hydroxit 3M.
3.4. Các phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm excel