3.3.1. Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Các gốc ghép được sử dụng: Gốc chấp, gốc bưởi Diễn, gốc cam Hàm Yên. Các công thức được bố trí như sau:
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ cây vi ghép sống và tốc độ sinh trưởng của các cây vi ghép, định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.2. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Hạt sau khi bóc vỏ cứng và vỏ lụa, để trong môi trường nuôi cấy sẽ được bố trí theo 3 công thức như sau
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ hạt nảy mầm và tốc độ sinh trưởng của hạt bưởi Diễn, định kỳ 5 ngày/ lần
3.3.3. Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Gốc ghép được theo dõi từ khi bắt đầu gieo hạt. Thí nghiệm được bố trí theo 4 công thức như sau:
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ cây vi ghép sống và tốc độ sinh trưởng của các cây vi ghép, định kỳ 5 ngày/ lần
3.3.4. Ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép
Theo dõi mầm ghép ngoài vườn ươm từ khi bắt đầu bật chồi. Mắt ghét được lấy trực tiếp từ cây cam sành và cam chanh Bố Hạ. Chỉ dùng mắt thức (mắt đã nổi rõ), không lấy mắt ghép trên cành còn non (cành phải được 3 tháng tuổi trở lên)
Thí nghiệm được bố trí theo 4 công thức:
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mắt ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.5. Ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép
Nghiên cứu dựa trên 3 kỹ thuật ghép: Mối ghép bằng, mối ghép áp, mối ghép hình chữ V. Các kỹ thuật được bố trí theo các công thức như sau.
Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép
Cây ghép được để ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: không có ánh sáng, ánh sáng yếu, ánh sáng bức xạ. Các điều kiện chiếu sáng được bố trí theo các công thức sau.
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến hiệu quả vi ghép Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ mầm sống và tốc độ sinh trưởng của mầm ghép theo định kỳ 5 ngày/ lần.
3.3.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Thu thập mẫu lá cây vi ghép, tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Dolye và cộng sự năm 1987 với sự biến đổi nhỏ để phù hợp với phòng thí nghiệm. Các bước tách chiết DNA tổng số như sau:
-Cắt nhỏ mẫu lá, chuyển vào ống effendorf loại 2,0 ml sạch, vô trùng. - Bổ sung 1ml lysis buffer + 2 viên bi sắt, chuyển vào máy đồng hóa mẫu. Tiến hành đồng hóa mẫu với 6 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4.000 vòng/phút trong 30 giây để thu được dạng dung dịch.
- Ủ mẫu đã đồng hóa ở 65°C trong 1h, cứ 10 phút đảo trộn mạnh bằng máy vortex 1 lần.
- Ly tâm ở tốc độ 12.500 vòng/phút trong 10 phút, thu 600 µl dịch nổi sáng ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng.
- Bổ sung 600 µl dung dịch hỗn hợp phenol: clorofome: isoamin alcohol (theo tỷ lệ 25:24:1, v:v:v), lắc đều.
- Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi sang ống eppendorf loại 1,5 ml mới, vô trùng.
- Bổ sung 50µl dung dịch sodium acetate 5M (pH = 5,5) và 500 µl dung dịch isopropanol, đảo trộn nhẹ nhàng.
-Ủ mẫu ở -20°C trong vòng tối thiểu 2h hoặc qua đêm.
-Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. - Bổ sung 1.000µl cồn 70%, đảo trộn bằng máy vortex, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cồn 70%.
- Mở nắp effendorf để bay hơi hoàn toàn cồn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
-Bổ sung 200µl dung dịch đệm TE 1% đảo trộn nhẹ. Để DNA hòa tan tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc ủ ở 70oC nếu cần hòa tan nhanh.
-Kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
3.3.8. Phương pháp PCR để phát hiện cây bị bệnh greening
Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để phát hiện bệnh greening trên cây vi ghép. Thành phần của phản ứng PCR như sau:
- 5X PCR Buffer: - dNTPs (2,5 mM):
- Mồi G-R (10 µM): - DNA khuôn:
- Taq DNA Polymerase (5U/µl):0,2 µl - Nước PCR:
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
- Giai đoạn Biến tính ban đầu: 95°C trong 10 phút - Giai đoạn khuếch đại: 40 chu kỳ, gồm:
+ Biến tính DNA: + Gắn mồi:
+ Kéo dài mạch:
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: - Ủ và bảo quản:
Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2,0%
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose, mẫu bị bệnh greening được biểu hiện bằng sự xuất hiện của sản phẩm PCR có kích thước khoảng 226 bp. Mẫu không hình thành sản phẩm PCR được coi là mẫu không bị bệnh greening.
3.3.9. Phương pháp kiểm tra bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA Bước 1. Chuẩn bị mẫu: ELISA Bước 1. Chuẩn bị mẫu:
- Cân 2,0 g mẫu lá, chuyển vào ống Eppendorf 2ml mới
- Bổ sung 2 viên bi và 1200 µl dung dịch extraction buffer chuyển vào máy đồng hoá mẫu. Tiến hành đồng hoá mẫu với 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4000 vòng/phút trong 30 giây để thu dịch nổi đồng nhất
- Ly tâm mẫu với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút, ở nhiệt độ 10°C - Sử dụng micropipet hút chuyển phần dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml mới
- Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4°C để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo
Lưu ý: Chỉ chuẩn bị mẫu ngay trước khi tiến hành thực hiện phản ứng ELISA, không chuẩn bị mẫu trước quá 1 ngày.
Bước 2: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu
- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng
- Rửa khay 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet hút toàn bộ dung dịch trong các giếng.
Bước3: Bổ sung mẫu phân tích
- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ 2h - 4h ở 37oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 4: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme
- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 5: Thêm cơ chất
- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate (Merck) trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl cơ chất vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt thường (khoảng 1-3h).
Bước 6: Kiểm tra kết quả
Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngưng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50µl Natri hydroxit 3M.
3.4. Các phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm excel
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Trong các kỹ thuật ghép, để cây ghép sinh trưởng phát triển tốt cần phải lựa chọn gốc ghép phù hợp. Các loại gốc ghép thường sử dụng là những loài cây dại, khỏe mạnh, chống chịu tốt, thích nghi với điều kiện môi trường và có quan hệ gần gũi về mặt di truyền với cây ghép. Trong nghiên cứu này, để tiến hành vi ghép cải tiến cam Bố Hạ, các loại gốc ghép là cam, chấp, bưởi diễn được lựa chọn để thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến được tổng hợp trong bảng 4.1 dưới đây:
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến (sau 30 ngày vi ghép)
Công thức
CT1 CT2 CT3
Dựa trên bảng 4.1 cho thấy: Sử dụng các loại gốc ghép khác nhau cho tỷ lệ cây vi ghép sống khác nhau rõ rệt. Trong đó, nếu sử dụng cam Hàm Yên làm gốc ghép, 100% số cây vi ghép bị chết. Gốc ghép là bưởi Diễn, 100% số cây vi ghép sống sau 30 ngày theo dõi. Trong khi đó, sử dụng chấp làm gốc ghép, số cây vi ghép sống là 5/30 cây, chiếm tỷ lệ 16,6%.
Hơn nữa, chấp và cam Hàm Yên là những loài có hạt đa phôi, 100% số hạt bưởi Diễn là hạt đơn phối. Vì vậy, để tạo cây gốc ghép, trong nghiên cứu chỉ sử dụng những hạt đơn phôi để gieo tạo cây gốc ghép. Các thử nghiệm khi sử dụng hạt đa phôi làm gốc ghép, cây gốc ghép sinh trưởng yếu, nhỏ không đủ điều kiện để ghép.
Sau khi gieo 3 tuần, gốc ghép đạt kích thước về chiều cao ở cam Hàm Yên, chấp và bưởi Diễn lần lượt là 2,8 cm, 3,5 cm và 5,0 cm tiến hành vi ghép cải tiến. Kết quả này cũng cho thấy, sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép, cây gốc ghép sinh trưởng tốt hơn, kích thước lớn hơn, dễ ghép hơn. Cây vi ghép sinh trưởng tốt hơn.
Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi khẳng định rằng sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép phù hợp để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ. Do vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép.
Hình 4.1. Hình ảnh 3 loại gốc ghép sau 25 ngày gieo hạt và 1 tuần vi ghép
A. Gốc bưởi Diễn; B. Gốc chấp; C. Gốc cam Hàm Yên D. Mầm ghép trên gốc bưởi; E. Mầm ghép trên gốc chấp F. Mầm ghép trên gốc cam
4.2. Kết quả theo dõi ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Điều kiện chiếu sáng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt. Một số loại hạt trong môi trường rừng tự nhiên sẽ không nảy mầm cho đến khi có lượng ánh sáng vừa đủ [17]. Trong nghiên cứu này, để tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến sự nảy mầm của hạt cây gốc ghép, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo 3 công thức với các thời gian chiếu sáng/ngày khác nhau, gồm: CT1 6 h/ngày, CT2 12 h/ngày và CT3 24 h/ngày. Dưới đây là kết quả nghiên cứu của 3 công thức trên sau 3 tuần gieo hạt.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn (sau 3 tuần gieo hạt)
Số Công lượng thức hạt CT1 30 CT2 30 CT3 30
Dựa trên kết quả của bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ nảy mầm các hạt là 100% ở tất cả các công thức, điều đó chứng tỏ ánh sáng không ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt bưởi Diễn. Tuy nhiên, sau 30 ngày theo dõi, so sánh về hình thái của mầm cho thấy, các hạt được chiếu sáng với thời gian khác nhau có hình thái khác nhau. Các hạt được chiếu sáng 6 h/ngày có mầm mập, màu xanh thẫm, các hạt được chiếu sáng 12 h/ngày (Công thức 2) có mầm bình thường còn các hạt được chiếu sáng 24 h/ngày mầm nhỏ.
Như vậy, hạt được chiếu sáng 6 h/ngày cho chất lượng mầm tốt nhất, tỷ lệ nảy mầm là 100%. Do đó, chúng tôi chọn thời gian chiếu sáng là 6 h/ngày trong 3 tuần để tạo cây bưởi Diễn làm gốc ghép.
Hình 4.2. Hình ảnh hạt bưởi sau 3 tuần gieo hạt
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Tuổi gốc ghép là một trong những tiêu chí quan trọng trong việc chọn thời điểm phù hợp tiến hành vi ghép để đạt được hiệu quả cao và cây vi ghép phát triển tốt. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn gốc ghép là bưởi Diễn, tiến hành vi ghép cải tiến khi gốc ghép được 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần tuổi. Kết quả thể hiện trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép bưởi Diễn đến hiệu quả vi ghép cam Bố Hạ (sau 30 ngày vi ghép)
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4
Kết quả thể hiện trong bảng 4.3 cho thấy: Tuổi của gốc ghép khác nhau cho tỷ lệ cây sống sau vi ghép khác nhau. Cụ thể, sử dụng gốc ghép 1 tuần tuổi, 100% mầm ghép bị chết. Tỷ lệ cây vi ghép sống tăng dần khi tuổi của mầm ghép tăng từ 2 tuần đến 3 tuân sau đó giảm xuống khi sử dụng gốc ghép 4 tuần tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở công thức 3, sử dụng gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi, tỷ lệ mầm ghép sống, sinh trưởng cao nhất, đạt 100%.
Trong quá trình theo dõi nghiên cứu chúng tôi cũng nhận thấy, gốc ghép ở giai đoạn 1 tuần tuổi rất non, yếu, khó ghép, mầm ghép bị chết. Khi sử dụng gốc ghép 2 tuần tuổi, gốc ghép mặc dù cứng hơn nhưng vẫn rất dễ bị gãy, khó tiến hành ghép. Khi sử dụng gốc ghép 4 tuần tuổi, phần thân của gốc ghép cứng, khó thao tác mặc dù tỷ lệ mầm ghép sống cao (đạt 90%). Cây gốc ghép 3 tuần tuổi có kích thước và độ cứng của thân phù hợp cho việc ghép mầm cam Bố Hạ, tỷ lệ sống của cây vi ghép cũng cao nhất (100% cây vi ghép sống, sinh trưởng).
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể rút ra kết luận là sử dụng gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi phù hợp nhất để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ. Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng gốc ghép là bưởi diễn 3 tuần tuổi.
Hình 4.3. Hình ảnh cây vi ghép sử dụng các gốc ghép với độ tuổi khác nhau (sau 30 ngày thao dõi)
A. Công thức 1; B. Công thức 2; C. Công thức 3; D. Công thức 4
4.4. Kết quả ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép
Tuổi của mầm ghép cũng là yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây vi ghép. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn vật liệu ghép là mầm cam Bố Hạ có độ tuổi từ 1 tuần đến 4 tuần. Tiến hành ghép trên gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi. Theo dõi tỷ lệ cây sống và cây chết sau