- Máy đo điện tâm đồ hiệu Fukuda (nước sản xuất: Nhật). - Cân SECA 701 dùng để đo trọng lượng.
- Máy đo INR hiệu STA compact (nước sản xuất Pháp) thực hiện tại khoa xét nghiệm bệnh viện Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Kỹ thuật giải trình tự gen: thực hiện tại Trung Tâm Y sinh Học Phân tử Trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
* Tách chiết DNA
2 ml máu tĩnh mạch được lấy vào ống xét nghiệm có chứa chất chống đông EDTA và chuyển đến Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM. DNA được tách chiết bằng bộ kit GeneJet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini (ThermoFisher Scientific). Tất cả các mẫu DNA đều có tỉ số A260/ A280 từ 1,8 đến 2, nồng độ DNA lớn hơn 10 ng/ml. Bảo quản lưu trữ dung dịch gDNA tại tủ -300C.
* Thiết kế mồi cho PCR
Các vị trí SNP của gen CYP2C9 và VKORC1 được xác định trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự các sản phẩm PCR tương ứng. Các cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm CLC Main Workbench (xem bảng). Vị trí rs1799853 trên exon 3 của gen CYP2C9 (tương ứng với CYP2C9*2 nếu có c.430C>T) được khuếch đại bằng cặp mồi 2C9-3F1 và 2C9-3R. Vị trí rs1057910 trên exon 7 của gen CYP2C9 (tương ứng với CYP2C9*1 nếu là c.1075A hoặc CYP2C9*3 nếu là c.1075C) được khuếch đại bằng cặp mồi 2C9-7F1 và 2C9-7R. Vị trí c.- 1639 của gen VKORC1 được khuếch đại bằng cặp mồi VK-F và VK-R1.
Bảng 2.11. Thông tin các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự chuỗi (5’–3’) Vùng gen
Kích thước sản phẩm
(bp)
2C9-3F1 GAGACTTACAGAGCTCCTCG rs1799853
(exon 3 của gen
CYP2C9)
316
2C9-3R GTAGAGAAGATAGTAGTCCA
2C9-7F1 TATACCCCTGAATTGCTACA rs1057910
(exon 7 của gen
CYP2C9) 323 2C9-7R TGATACTATGAATTTGGGGA VK-F GCCAGCAGGAGAGGGAAATA c.-1639 (vùng khởi động của gen VKORC1) 449 VK-R1 CCAAGACGCTAGACCCAATG
* Thiết lập điều kiện PCR
Mỗi phản ứng (20 µl) bao gồm các thành phần: 0,2 µl Taq DNA polymerase (5U) của Takara; 2 µl đệm 10X; 2 µl dNTPs (2,5mM); 1 µl mỗi loại mồi (10 µM); 1,5 µl genomic DNA (100 ng/µl) và 12,3 µl H2O. Kỹ thuật PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) với chu trình nhiệt như sau: khởi đầu phản ứng ở 98oC trong 3 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ (98oC trong 10 giây, 58oC trong 20 giây, 72oC trong 40 giây) và kết thúc ở 72oC trong 5 phút. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm.
* Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới hệ thống chụp gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ).
* Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm sau khi làm PCR được tinh sạch bằng kitExoSAP-IT® PCR ProductCleanup (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
* Thực hiện giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ và thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi đoạn cần đọc. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến tính ở 95oC trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench và được minh họa trong hình dưới đây: