- Hàm lượng tro của nguyên liệu
3.2.3.Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết thân
3.2.2.3. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Mẫu thân cây sống đời sau khi tro hoá được hoà tan bằng dung dịch HNO3 đặc 65-68% và định mức đến 250 ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm phân tích môi trường – Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung trung bộ, số 660 - Trưng Nữ Vương, TP. Đà Nẵng.
Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau: (m g /l) (m g /k g ) C C 25 0 5, 0 2 5
Trong đó, m0 : khối lượng mẫu thân cây sống đời trước khi tro hóa
3.2.3. Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết thân cây sống đời cây sống đời cây sống đời
Khoảng 1(kg) nguyên liệu bột khô được ngâm chiết trong MeOH ba lần với mỗi lần 1 lít dung môi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày, thu lấy dịch chiết. Phần dịch chiết này được cất quay dưới áp suất giảm để đuổi dung môi, thu đươc cao tổng MeOH. Cao tổng này được chế thêm 200 ml nước cất. Chiết phân lớp lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate, butanol bằng phễu chiết. Mỗi dung môi cũng tiến hành chiết 3 lần, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Làm khan nước các dịch chiết này bằng Na2SO4.
Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5 ml để đem phân tích GC – MS xác định thành phần và hàm lượng các cấu tử có trong mỗi dịch chiết. Hệ thống GC-MS với cột tách mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, thể tích tiêm mẫu 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+ kèm ngân hàng dữ liệu và theo
chương trình gradient nhiệt độ: từ 500C đến 3000C (5 phút); injector 2500C và detector 500, chế độ quét Fullscan.
Toàn bộ các phần dịch chiết còn lại được cất quay dưới áp suất giảm để đuổi hết dung môi thu được: 5.914g cao n–hexane, 5.351g cao EtOAc và 12.875g cao BuOH.
3.2.4. Phân lập chất trong cao chiết n-hexane
Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu phân lập và tinh chế chất trong cao chiết n-hexane thân cây sống đời.
Cao chiết n-hexane được tách và tinh chế bằng sắc kí cột thường kết hợp sắc kí bản mỏng silicagel.
Để phân lập và tinh chế chất chúng tôi sử dụng:
- Sắc kí bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 hãng Merck, dày 0.25mm tráng trên nền nhôm.
- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06mm. Hình 3.3. Sơ đồ chiết mẫu thân cây sống đời
Thân sống đời (5kg)
Cao MeOH
1. Sấy khô, xay bột 2. Ngâm chiết với MeOH (3 lần x 1 lít)
3. Cất loại dung môi
Cao n-hexane (5.914g) Cao EtOAc (5.351g) Cao BuOH (12.875g) 1. Thêm 200ml nước cất 2. Chiết phân lớp lần lượt với các dung môi :
n-hexane, EtOAc, BuOH 3. Cất loại dung môi
- Cột sắc kí là ống thủy tinh có kích thước 2 cm x 80 cm, bên dưới có van khóa.
- Thuốc thử phun lên bản mỏng sử dụng vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy bản mỏng ở nhiệt độ khoảng 1100C.
Chuẩn bị thuốc thử: Lấy vào bình tam giác 200ml MeOH, thêm 25 ml CH3COOH, làm lạnh hỗn hợp. Sau đó, thêm từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc. Cân 1.2 g vanilin. Cho từ từ từng lượng nhỏ vanilin vào hỗn hợp trên, vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều.
Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí bản mỏng với các bước sau:
+ Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu trong dung môi CHCl3.
+ Chuẩn bị 5 tấm bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
+ Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexane/EtOAc (với các tỉ lệ 95:5, 90:10, 85:15), CHCl3/MeOH (99:1), CHCl3/CH3COCH3 (8:2). Tiếp theo hiện hình bằng thuốc thử. Bản mỏng nào có sự tách vệt rõ ràng, các vệt nằm trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng thì hệ dung môi tương ứng đó là thích hợp để chạy cột sắc kí.
Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n-hexane/EtOAc.
Chuẩn bị cột sắc kí
Cố định cột trên giá. Cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng.
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nhồi vào cột sắc kí theo phương pháp nhồi sệt.
Cho hệ dung môi n–hexane : EtOAc = 95 : 5 vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí bản mỏng).
Lấy 150 gam silicagel cho từ từ từng lượng nhỏ vào cốc đựng hệ dung môi trên vừa khuấy đều để đuổi hết bọt khí, thu được một hỗn hợp sệt đồng nhất để nhồi vào cột sắc kí.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột được đồng nhất. Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột. Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng.
Nạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khô.
5.012g cao n-hexane hòa tan vừa đủ bằng CHCl3 trong bình cầu, thêm 5 gam silicagel, quay cất đến khô để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
Mẫu khô đã được làm tơi mịn được cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khô thì lượng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung môi, không có bọt khí (hình 3.4). Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột.
Hình 3.4. Cột sắc kí
Chạy cột silicagel với hệ dung môi n–hexane / EtOAc tăng dần độ phân cực, thu được 140 phân đoạn nhỏ (đánh số từ 1- 140), mỗi phân đoạn 15 ml. Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng, những phân đoạn
giống nhau được gom thành một nhóm phân đoạn
lớn. Kết quả thu được 8 nhóm phân đoạn như sau: H1 = (1-17) H5 = (77-102) H2 = (18-49) H6 = (103-118) H3 = (50-63) H7 = (119-126) H4 = (64-76) H8 = (127-140)
Sau khi kiểm tra sắc kí bản mỏng các nhóm phân đoạn, chúng tôi nhận thấy các nhóm phân đoạn H2 và H5 có sự tách vệt rõ ràng, ít tạp chất nên chúng tôi tiến hành tinh chế lại trên cột sắc kí với các hệ dung môi thích hợp. Các phân đoạn còn lại, vì lượng mẫu cho vào cột không nhiều mà số lượng chất trong mỗi phân đoạn lớn, đồng thời các chất có Rf tương tự nhau nên rất khó tách được đủ lượng chất sạch cần thiết để xác định cấu trúc, việc tách
không khả thi lắm nên chưa được nghiên cứu. Qúa trình phân lập chất từ cao chiết n-hexane được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Sơ đồ phân lập và tinh chế chất từ cao chiết n-hexane
Nhóm phân đoạn H2 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được khối chất rắn vô định hình và được tinh chế lại trên sắc kí cột chậm silicagel, dung môi rửa giải là n-hexane : EtOAc = 95:5 thu được 27 mg chất sạch, kí hiệu là SDH2. Chất SDH2 là chất rắn vô định hình, màu vàng nhạt; chấm bản mỏng hệ dung môi n-hexane: EtOAc = 90:10, phun thuốc thử vanillin 1%/methanol - H2SO4 đặc, hơ nóng ở khoảng 1100C hiện 1 vệt màu xanh dương có Rf = 0,5 (hình 3.6).
Nhóm phân đoạn H5 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được khối chất rắn vô định hình và được tinh chế lại trên sắc kí cột chậm silicagel, dung môi rửa giải là n-hexane : EtOAc = 90:10 thu được 50 mg chất sạch, kí hiệu là SDH5. Chất SDH5 là tinh thể hình kim, màu trắng; chấm bản mỏng hệ dung môi là n-hexane : EtOAc = 80:20, phun thuốc thử vanillin 1%/methanol - H2SO4 đặc, hơ nóng ở khoảng 1100C cho 1 vệt màu tím có Rf = 0,4 (hình 3.6). Cao n-hexane (5.012g) SKC, n-hexane/EtOAc (95:5 – 40:60) 140 phân đoạn pđ 18 – 49 SKC, n-hexane/EtOAc (95:5) pđ 77-102 SKC, n-hexane/EtOAc (90:10) SDH2 (27mg) SDH5 (50mg)
Các chất SDH2 và SDH5 được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại.
Hình 3.6. SKBM của chất SDH2 và SDH5
CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 4.1.1. Độ ẩm 4.1.1. Độ ẩm 4.1.1. Độ ẩm
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của thân cây sống đời tươi và của nguyên liệu bột khô được xác định và tổng hợp ở bảng 4.1và bảng 4.2.
STT m1(g) m2 (g) m3 (g) (%) TB (%)
1 95. 82 5.01 97.23 71.87
71.82
2 93.32 5.04 94.74 71.83
3 97.17 5.03 98.58 71.77
Bảng 4.2. Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô thân cây sống đời
STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%) TB (%) 4 92.99 5.02 97.74 5.38 5.32 5 90.21 5.00 94.94 5.40 6 95.89 5.01 10.64 5.19 Trong đó: m1 : Khối lượng chén sứ
m2 : Khối lượng mẫu thân cây sống đời
m3 : Khối lượng chén sứ và mẫu thân cây sống đời sau khi sấy (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu
TB (%) : Độ ẩm trung bình
Nhận xét:
- Độ ẩm trung bình của thân cây sống đời tươi là 71.82%. Cây sống đời là loài mọng nước nên độ ẩm của thân cây sống đời tương đối cao. Độ ẩm thay đổi tùy thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng nơi cây sống đời sinh trưởng. Với việc tích lũy lượng nước lớn giúp cây sống đời có thể sinh tồn được ở những vùng khí hậu khắc nghiệt nhất như Bắc bán cầu hay Châu Phi, vùng sa mạc Sahara.
- Độ ẩm trung bình của nguyên liệu bột là 5.32%. Nguyên liệu khô ráo sẽ hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật nên thuận lợi cho việc bảo quản
nguyên liệu. Với độ ẩm này, chúng tôi đã bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài nhưng không bị mốc, nguyên liệu có độ ổn định tốt.
4.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và tổng hợp ở bảng 4.3. xác định và tổng hợp ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong thân cây sống đời STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) m4 (g) mtro (g) H(%) Htb(%)
1 30.726 35.728 5.002 35.625 0.103 2.059
2.091 2 33.429 38.435 5.006 38.329 0.106 2.117
3 30.186 35.195 5.009 35.090 0.105 2.096 Trong đó: m1: khối lượng cốc
m2: khối lượng cốc và mẫu trước khi tro hoá m3: khối lượng mẫu
m4: khối lượng cốc và mẫu sau tro hoá
H (%) : hàm lượng tro trong thân cây sống đời
Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình trong thân cây sống đời là 2.091%. Điều này dự báo hàm lượng kim loại có trong thân cây sống đời là rất ít.
4.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng một số kim loại trong thân cây sống đời được xác định bằng phương pháp đo AAS. Kết quả được tổng hợp ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả xác định hàm lượng kim loại trong thân cây sống đời
TT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) [1] 1 Pb TCVN 6193:1996 0.0425 0.8458 2
2 Cu TCVN 6193:1996 0.3799 7.5423 30
3 Zn TCVN 6193:1996 0.7667 15.2580 40
4 As TCVN 6826:2000 0.0098 0.1950 1
Nhận xét:
Thành phần kim loại nặng có trong thân cây sống đời thấp. Kết quả so sánh với tiêu chuẩn về hàm lượng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm [1] thì các hàm lượng kim loại nặng nằm trong khoảng cho phép. Đây là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá việc sử dụng thân cây sống đời làm dược liệu an toàn, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.