- Hàm lượng tro của nguyên liệu
2.2.6. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Dựa theo công dụng của thân cây sống đời trong các bài thuốc dân gian, chúng tôi tiến hành thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các dịch chiết từ thân cây sống đời trong đề tài nghiên cứu này.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện theo phương pháp pha loãng nồng độ của Hadacek F. và Greger H.–2000 tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng theo hai bước.
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm dịch chiết và các chất có hoạt tính.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế 50% của chất và của dịch chiết có hoạt tính. Chất đối chứng bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn [Gram (+)]. Tetraxilin đối với vi khuẩn [Gram (–)], Nystasin đối với nấm sợi.
Các chủng vi sinh vật được chọn để thử gồm các vi khuẩn [Gram (–)], Escherichia coli (E.C.), Pseudomonas aeruginosa (P.A.), Salmonella enteric (S.E.).
+ E.C. thuộc nhóm trực khuẩn thường sống ở đường ruột và gây một số bệnh ở người như tiêu chảy, viêm ruột thừa.
+ P.A. là trực trùng mủ xanh thường gây mủ nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, tiêu chảy, khó điều trị.
+ S.E. là vi khuẩn gây bệnh đường ruột như sốt thương hàn, ngộ độc thực phẩm.
Các chủng vi sinh vật [Gram(+)] bao gồm: Bacillus subtilis (B.S.), Staphylococcus aureus (S.A.), Lactobacillus fermentum (L.F. ). Và nấm được chọn để thử là Candida albicans (C.A.).
+ B.S. là vi khuẩn sống dai và ít gây bệnh.
+ S.A. là vi khuẩn tụ cầu gây bệnh ở người, chủ yếu là các bệnh cấp tính.
+ L.F. là một probiotic, vi khuẩn có lợi, giúp tăng cường hệ thống miễn dịch ở người.
+ Nấm men C.A. thường mọc ở biểu mô miệng, gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em, có thể sống ở âm đạo gây bệnh khí hư ở phụ nữ.
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud dextros broth và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch DMSO 100% với 4 – 10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ trong phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị MeLand (khoảng 108 vsv/ml). Để trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC trong 48 giờ đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật và nấm IC50 (μg/ml). Việc thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện tại phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hoá học – Viện KHCN Việt Nam.
CHƯƠNG 3 – CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
Qúa trình thực nghiệm được mô tả theo sơ đồ thể hiện ở hình 3.1. NGUYÊN LIỆU
Thân cây sống đời tươi (5kg) Xác định các thông số hóa lí Độ ẩm Hàm lượng tro Hàm lượng kim loại
Sấy khô, xay bột Bột nguyên liệu khô
(1kg) Xác định độ ẩm
1. Ngâm chiết với MeOH (3 lần x 1 lít) 2. Cất loại dung môi Cao MeOH
3.2. THỰC NGHIỆM 3.2.1. Xử lí nguyên liệu 3.2.1. Xử lí nguyên liệu 3.2.1. Xử lí nguyên liệu
Nguyên liệu là thân cây sống đời ở Đà Nẵng, thu hái vào tháng 3/2012. Chọn hái những thân tươi, không bị hư, sâu, cắt phần trên mặt đất, bỏ cành con và lá. Thân hình trụ, có độ cao khoảng từ 0.4 – 0.6m, đường kính khoảng 0.5 - 0.7cm. Mặt ngoài vỏ màu xanh tía, có các vết sẹo cành và vết sẹo lá mọc đối. Ở giữa thân có tủy xốp màu trắng xanh, mùi thơm nhẹ, vị ngọt hơi chua.
Thân sống đời được rửa sạch, loại bỏ tạp bẩn, để ráo nước rồi thái nhỏ. Thân đã thái nhỏ được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C. Trong quá trình sấy, thỉnh thoảng dùng tay trộn xới nguyên liệu để nguyên liệu được khô đều. Nguyên liệu khô đem xay nhỏ, thu được 1.1 kg bột (hình 3.2).
Hình 3.2. Nguyên liệu thân sống đời tươi và bột khô 3.2.2. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu
3.2.2.1. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các chén sứ.
+ Xác định độ ẩm của thân tươi: Lấy vào 3 chén sứ, mỗi chén khoảng 5 gam thân cây sống đời tươi đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ). Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và chén sứ giữa 2 lần cân không đổi là được. Ghi lại giá trị khối lượng đó. Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân. Từ đó suy ra độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
+ Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu bột: cho vào 3 chén sứ, mỗi chén khoảng 5 gam nguyên liệu bột đã chuẩn bị ở trên. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như đối với xác định độ ẩm của thân tươi.
Cách tính độ ẩm: - Độ ẩm mỗi mẫu: 1 2 3 2 (m m ) m % 100% m
- Độ ẩm trung bình: 3 1 TB (%) (%) 3
Trong đó, m1(gam) : Khối lượng bì chén sứ
m2 (gam): Khối lượng mẫu thân cây sống đời ban đầu
m3(gam) : Khối lượng chén sứ và mẫu thân cây sống đời sau khi sấy khô
(%) : Độ ẩm của mỗi mẫu TB (%) : Độ ẩm trung bình 3.2.2.2. Xác định hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
Dụng cụ: chén sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: Để xác định hàm lượng tro trong thân cây sống đời, ta cân khoảng 5 gam thân tươi, cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lượng. Cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở 7000C. Sau thời gian tro hoá khoảng 12 giờ, ta thấy thân cây sống đời bị tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng. Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra, thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số 0.001 thì dừng lại. Hàm lượng tro trong thân cây sống đời tươi được tính theo công thức:
1 0 .100% m H m
Trong đó, m0 (gam): khối lượng mẫu thân cây sống đời tươi trước khi tro hoá m1 (gam): khối lượng tro