6. Bố cục luận văn
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là củ nghệ đen đƣợc thu hái tại Gia Lai vào tháng 11/2014.
Hình 2.1. Củ nghệ đen mới thu hái
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Củ nghệ đen đƣợc thu hái về, rửa sạch, xắt lát rồi phơi khô, sau đó xay thành bột mịn và bảo quản trong bình kín.
2.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
Các hóa chất hữu cơ gồm: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol.
Các hóa chất vô cơ gồm: axit HNO3 đậm đặc, NaCl, Na2SO4...
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Thiết bị đo sắc ký khí ghép ph khối (GS/MS) Agilent 7890A/5975C, máy quang ph hấp thụ nguyên tử (AAS) của trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn chất lƣợng II tại TP-Đà Nẵng.
Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, máy cô quay chân không. Các dụng cụ thí nghiệm khác nhƣ: bộ chiết soxhlet 250 ml, bộ chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc.
Hình 2.4. Máy AAS (ZEEnit 700) Hình 2.5. Máy GC/MS (Agilent 7890A)
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp xác định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm của củ nghệ đen tƣơi, khô và hàm lƣợng tro của nguyên liệu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trọng lƣợng.
b. Phương pháp vật lý
Hàm lƣợng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu đƣợc xác định phƣơng pháp quang ph hấp thụ nguyên tử (AAS).
2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi củ nghệ đen. Trong đề tài tôi tiến hành chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc để thu tinh dầu và chiết soxhlet với các dung môi hữu cơ.
a. Chiết tách tinh dầu bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước
Mẫu nguyên liệu là củ nghệ đen tƣơi sau đó giã nhỏ và tiến hành chiết tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
Nguyên liệu và nƣớc cùng cho vào một thiết bị. Ngay khi nguyên liệu đƣợc làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nƣớc lôi cuốn đi. Ở phƣơng pháp chƣng cất này nƣớc phủ kín nguyên liệu, nhƣng phải chừa một khoảng không gian tƣơng đối lớn phía bên trên lớp nƣớc, để tránh khi nƣớc sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lƣu. Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu. Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nƣớc cuốn đi. Còn nƣớc đi vào nguyên liệu theo chiều ngƣợc lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lƣợng nƣớc này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết. Sự chƣng cất này thƣờng không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải. Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phƣơng pháp này.
Hình 2.8. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước
Phƣơng pháp này đơn giản, thiết bị rẻ tiền và dễ chế tạo, phù hợp với những cơ sở sản xuất nhỏ, vốn đầu tƣ ít. Tuy nhiên, phƣơng pháp này còn một vài nhƣợc điểm nhƣ hiệu suất thấp, chất lƣợng tinh dầu không cao do nguyên liệu tiếp xúc trực tiếp với thiết bị nên dễ bị cháy khét, khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật nhƣ tốc độ và nhiệt độ chƣng cất.
b. Chiết bằng dung môi hữu cơ
Mẫu thực vật khô là củ nghệ đen đã đƣợc nghiền nhỏ tiến hành chiết soxhlet lần lƣợt với từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau nhƣ n–
hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol. Thiết bị có bán sẵn với
nhiều cỡ lớn nhỏ khác nhau, từ bình cầu 250 ml đến 15 lít.
Dụng cụ: bộ chiết soxhlet gồm hai bộ phận tháo ráp đƣợc tại các vị trí nút mài (1) và (2). Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột củ nghệ đen gồm ba ống: ống D có đƣờng kính lớn, ở giữa, để chứa bột nghệ đen; ống B có đƣờng kính trung bình, để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột nghệ đen; ống E có đƣờng kính nhỏ, là ống thông nhau để dẫn dung môi từ D trả ngƣợc trở lại bình cầu. Trên cao nhất là ống C ngƣng hơi (Hình 2.9).
Thực hành: bột củ nghệ đen xay thô đƣợc đặt đƣợc đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để dễ lấy bột củ nghệ đen ra khỏi máy. Lƣu ý đặt vài viên bi thủy tinh dƣới đáy ống D để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Không đƣợc để lƣợng bột củ nghệ đen trong ống D cao hơn vƣợt hơn mức cong của ống thông nhau E.
Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài số (2), nhƣ thế dung môi sẽ thấm ƣớt bột củ nghệ đen rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E. Lƣu ý để thể tích lƣợng dung môi trong bình cầu không đƣợc nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu.
Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nƣớc chảy hoàn lƣu trong ống ngƣng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho cho dung môi trong bình cầu sôi đều nhẹ. Dung môi tinh khiết khi đƣợc đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơi, rồi theo ống ngƣng hơi để lên cao hơn nữa, nhƣng tại đây hơi dung môi bị ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột nghệ đen. Dung môi ngấm vào bột củ nghệ đen và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lƣợng dung môi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E, vì đây là ống thông nhau. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lƣợng dung môi đang chứa trong ống D.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo nhƣ mô tả lúc đầu. Các hợp chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột củ nghệ đen. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (2), rút lấy một giọt dung môi và thử trên miếng kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đu i dung môi, thu đƣợc cao chiết.
A
Hình 2.9. Bộ chiết soxhlet
2.2.3. Phƣơng pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết các dịch chiết
Trong luận văn này chúng tôi phân tích và định danh thành phần hóa học các dịch chiết:
- Chiết tinh dầu nghệ đen bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
- Chiết các cấu tử từ củ nghệ đen với các dung môi hữu cơ: n-hexane,
ethyl acetate, dichloromethane, methanol bằng phƣơng pháp chiết soxhlet. Những cấu tử trong các dịch chiết này đƣợc định danh bằng phƣơng
pháp đo sắc kí khí ghép ph khối (GC/MS). Phƣơng pháp GC/MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc kí khí (GC) với máy khối ph (MS). Các chất sau khi đi qua cột GC có thể bị ion hóa và có khả năng đầy đủ để phân tích bởi máy
Ống ngƣng hơi C
Nút mài (2)
Ống thông nhau E Nút mài (1)
Túi vải chứa bột cây Ống B Bếp đun Viên bi thủy tinh Dung môi Bình cầu
khối ph MS. Kĩ thuật sắc kí cho phép tách các cấu tử của hỗn hợp, có đƣợc các chất “nguyên chất” để đƣa vào máy khối ph với khả năng nhận diện rất ƣu việt, đặc biệt là những chất có đặc trƣng lƣu giữ giống nhau hoặc tƣơng tự nhau nhƣng có ph khối khác nhau nhờ đó có thể nhận diện đƣợc chúng. Phƣơng pháp này chỉ đƣợc giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dƣới thể hơi.
2.2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
Tinh dầu chiết đƣợc từ củ nghệ đen đƣợc thử hoạt tính kháng sinh và hoạt tính chống oxy hóa tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật và nấm sau dùng để thử nghiệm:
Gram (+) - Staphylococcus aureus - Bacillus subtilis - Lactobacillus fermentum Gram (-) - Salmonella enterica - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa Nấm Candida albicans
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.3.1. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu
a. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm.
Tiến hành: chuẩn bị 3 chén sứ và đánh số thứ tự từ 1 đến 3, các chén sứ đƣợc rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lƣợng không đ i. Sấy xong để vào
bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lƣợng các chén sứ. Sau đó, ta cho vào mỗi chén sứ m(g) bột và cân đƣợc chén và mẫu. Ghi lại giá
trị khối lƣợng (m1). Sau đó, tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050
C, sau 5 giờ lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội hẳn thì tiến hành cân phân tích để xác định khối lƣợng. Kế tiếp, cứ khoảng 1giờ ta lại tiến hành quá trình trên nhiều lần nữa cho đến khi khối lƣợng giữa 2 lần cân liên tiếp không
thay đ i thì dừng quá trình sấy. Ghi lại giá trị khối lƣợng đó (m2).
-Độ ẩm mỗi mẫu: 1 2 ( ) W(%) m m 100% m (2.1) - Độ ẩm trung bình: 3 1W(%) W (%) 100% 3 TB (2.2) Trong đó:
m1: khối lƣợng chén và mẫu bột trƣớc khi sấy (g)
m2: khối lƣợng chén và mẫu bột sau khi sấy (g)
m: khối lƣợng mẫu bột (g) w: độ ẩm của mỗi mẫu (%)
wTB: độ ẩm trung bình (%)
b. Xác định hàm lượng tro
Dụng cụ: chén sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: lấy chén sứ sau khi đã đƣợc xác định độ ẩm, ta đem tro hóa
trong lò nung ở nhiệt độ 5000
C. Sau thời gian tro hoá khoảng 8 giờ, ta thấy tro ở dạng bột mịn, màu xám trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lƣợng (m3).
3 0 (%) m m 100% H m (2.3) 3 1 (%) (%) 100% 3 TB H H (2.4) Trong đó:
m3: khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa (g)
m0: khối lƣợng chén sứ (g)
m: khối lƣợng mẫu bột (g) H: hàm lƣợng tro mỗi mẫu (%)
HTB: hàm lƣợng tro trung bình (%)
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Dùng phƣơng pháp đo quang ph hấp thụ nguyên tử AAS để xác định hàm lƣợng kim loại: Pb, Cu, Zn, Hg, As có trong củ nghệ đen tại trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn chất lƣợng II tại TP.Đà Nẵng.
Nguyên tắc của phƣơng pháp là đo sự hấp thụ năng lƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trƣờng hấp thụ, cụ thể nhƣ sau:
- Xác định hàm lƣợng kim loại Hg dùng phƣơng pháp AOAC 2010 (971.21) PK2-F08.
- Xác định hàm lƣợng kim loại Pb dùng phƣơng pháp AOAC 2010 (999.11) PK2-F11.
- Xác định hàm lƣợng kim loại As dùng phƣơng pháp AOAC 2010 (999.11) PK2-F02.
2.3.2. Nghiên cứu chiết tách tinh dầu từ củ nghệ đen
a. Quy trình chiết tách tinh dầu
Hình 2.10. Quy trình chiết tách tinh dầu từ củ nghệ đen
b. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng tinh dầu
Khảo sát tỉ lệ rắn–lỏng: Cân 200 g củ nghệ đen tƣơi đã giã nhỏ, tiến hành chiết với lần lƣợt với các lƣợng nƣớc là 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml,
800 ml trong thời gian 3 giờ.
Khảo sát thời gian chưng cất: Cân 200 g củ nghệ tƣơi đã giã nhỏ, tiến hành chƣng chất với thể tích nƣớc tốt nhất. Tiến hành khảo sát lƣợng tinh dầu thu đƣợc theo thời gian là 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ .
Củ nghệ đen tƣơi Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu sạch t Chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Tinh dầu thô
1.Chiết Tinh dầu 2. Làm khan bằng Na2SO4 Xác định chỉ số hóa lý Xác định thành phần hóa học Xác định độ ẩm và hàm lƣợng tro của nghệ tƣơi Thăm dò hoạt tính sinh học
c. Định lượng tinh dầu, xác định các chỉ số lý hóa của tinh dầu. Định lượng tinh dầu
Theo phƣơng pháp dƣợc điển Việt Nam, hàm lƣợng tinh dầu đƣợc tính theo công thức
% tinh dầu = (2.5)
Xác định độ trong và màu sắc
Dùng ống hút lấy 20 ml mẫu cho vào ống nghiệm khô, sạch, trong suốt. Dùng mắt quan sát độ trong và màu sắc của tinh dầu. Nếu tinh dầu còn vẩn đục không trong suốt chứng tỏ còn lẫn tạp chất và nƣớc.
Xác định mùi
Nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy lọc. Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu, cứ 15 phút xác định một lần, khoảng 4-5 lần. Nhận xét cƣờng độ mùi sau mỗi lần ngửi.
Xác định vị
Cân khoảng 1 g đƣờng kính cho vào chén sứ khô, sạch. Nhỏ vài giọt tinh dầu vào chén, trộn đều, dùng lƣỡi xác định vị của hỗn hợp đó. Ghi nhận xét về bản chất (độ ngọt, đắng) và cƣờng độ vị sau mỗi lần nếm.
Xác định tỉ trọng
Tỉ trọng của tinh dầu là tỉ số của khối lƣợng tinh dầu ở 200C với khối
lƣợng của cùng một thể tích nƣớc cất cũng ở 200
C.
Tỉ trọng của tinh dầu là một trong những chỉ tiêu quan trọng để biết đƣợc phẩm chất và độ tinh khiết của tinh dầu, giúp ta phán đoán về thành phần hóa học của tinh dầu.
Tỉ trọng của tinh dầu thƣờng dao động trong khoảng từ 0.7÷1.2. Biết đƣợc tỉ trọng của tinh dầu có thể phán đoán đƣợc thành phần hóa học của nó.
mạch thẳng.
- Nếu d > 1 thì tinh dầu chứa những hợp chất có oxi chủ yếu là phenol. - Nếu d = 0.9–1 thì tinh dầu chứa những hợp chất thuộc dãy rƣợu, andehyt, xeton.
Dụng cụ đo tỉ trọng là bình đo picnomet 10 ml.
Cách đo: Ban đầu ta cân chính xác picnomet 10 ml khô trên cân phân tích, rồi cân khi có nƣớc và khi có tinh dầu cần đo. Tỉ lệ giữa khối lƣợng tinh dầu và nƣớc chính là tỉ trọng d cần xác định. d = 0 2 0 1 m m m m (2.6) Trong đó: m0 : khối lƣợng của bình (g)
m1: khối lƣợng của bình có tinh dầu (g)
m2: khối lƣợng của bình có nƣớc cất (g)
* Lƣu ý: thể tích của tinh dầu và nƣớc khi xác định phải ở cùng một nhiệt độ. Kết quả đo 2 lần không sai lệch nhau quá 0.001 g, lấy kết quả trung bình của những lần đo tiếp theo.
Xác định chỉ số khúc xạ
Chỉ số khúc xạ tƣơng đối giữa hai môi trƣờng là tỉ số vận tốc ánh sáng trong chân không và vận tốc ánh sáng trong môi trƣờng đang xét. Chỉ số khúc xạ tƣơng đối bằng sin của góc tới chia cho sin của góc khúc xạ:
n = sin sin = 2 1 c c (2.7) Trong đó: α: góc tới β: góc khúc xạ
c2: tốc độ ánh sáng trong môi trƣờng chứa tia khúc xạ (tinh dầu)