Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

6. Bố cục đề tài

1.4.2. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

a. Giới thiệu phương pháp

thụ của khối vật chất đó phụ thuộc vào bản chất của nó, như vậy đo lượng tia bức xạ bị hấp thụ ta có thể xác định được tính chất của vật liệu. Phổ hấp thụ ứng dụng tốt nhất đối với những nguyên tử hoặc phân tử nhỏ[24].

Đo quang là một phương pháp định lượng phân tích dựa vào sự so sánh cường độ màu hay độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch nghiên cứu và dung dịch

chuẩn để xác định nồng độ của chất với độ nhạy khoảng 10-6g (sai số khoảng 0.2-10%) có nghĩa là đạt yêu cầu của phân tích lượng vết.

Phương pháp này được dùng chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, tốn ít thời gian so với các phương pháp khác.

b. Kỹ thuật thực nghiệm

Những bộ phận chủ yếu của máy đo UV-VIS là: nguồn bức xạ, bộ phận tạo đơn sắc,bộ phận chia chùm sáng, bộ phận đo và so sánh cường độ ánh sáng rồi chuyển thành tín hiệu điện (detector)và bộ phận ghi phổ.

Để phát bức xạ tử ngoại ta dùng đèn đơteri còn để phát bức xạ khả kiến người ta dùng đèn W/I2. Bộ phận tạo đơn sắc thường dùng lăng kính thạch anh có nhiệm vụ tách riêng từng dãi song hẹp đơn sắc. Bộ phận chia chùm sáng sẽ hướng chùm tia đơn sắc luân phiên đi tới cuvet đựng dung dịch mẫu và cuvet đựng dung môi. Bộ phận phân tích sẽ so sánh cường độ chùm sáng đi qua dung dịch I và đi qua dung môi I0. Tín hiệu quang được truyền thành tín hiệu điện. Sau khi được phóng đại, tín hiệu sẽ chuyển sang bộ phận tự ghi để vẽ đường cong sự phụ thuộc của lg(I/I0) vào bước sóng.

Cơ sở của phương pháp phân tích quang phổ tuân theo định luật Lambe- Bia:

A = lg(I/I0) = elC

Trongđó: A: là độ hấp thụ (hay là mật độ quang) C: là nồng độ chất tan (mol/l)

e: là hệ số hấp thụ mol đặc trưng cho cường độ hấp thụ của chất nghiên cứu.

1.4.3. Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)

a. Khái quát về phương pháp sắc kí khí (GC–GasChromatography)

- Sắc kí khí là một phương pháp chia tách trong đó pha động là một chất khí (được gọi là khí mang, khí mang thông dụng và thích hợp thường dùng là heli) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột. Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh chia thành hai loại sắc kí.

+ Sắc kí khí – rắn (GSC): Chất phân tích được hấp thụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.

+ Sắc kí khí – lỏng (GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không bay hơi. - Với sắc kí khí, có hai loại kỹ thuật phân tích:

+ Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình tách, phương pháp này khó tách hoàn toàn.

+ Thay đổi nhiệt độ trong quá trình tách, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng tách hoàn toàn[24].

b. Phương pháp khối phổ (MS)

- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trường hay từ trường nhất định.

- Máy khối phổ là thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó.

- Theo tính năng của bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành hai loại: + Máy khối phổ kí ghi bằng kính ảnh: Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở dạng vạch có độ đen khác nhau.

+ Máy khối phổ kế: Các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện bằng các dao động kí điện tử nhiều kênh, hoặc đưa vào máy tính điện tử,

tín hiệu sẽ được đưa ra dưới dạng bản đồ hoặc đồ thị thích hợp.

Ngày nay trong phương pháp khối phổ người ta dùng các máy khối phổ kế. - Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:

Mẫu các chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo phổ. Để đo được các đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion. Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài. Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính[24].

c. Sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS

Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS) dựa trên cơ sở nối ghép máy sắc kí và khối phổ. GC-MS là một phương pháp với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí.

d. Công dụng của máy sắc ký ghép khối phổ GC-MS

- Phân tích: GC-MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước. Ở đây, tốc độ được quyết định bởi tính bay hơi. Chất nào có tính bay hơi cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay hơi thấp.

- Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC-MS.

- Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó. Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết. Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện, ta thu được một dữ liệu mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này[24].

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1. Nguyên liệu

a. Thu nhận nguyên liệu

- Nguyên liệu củ nghệ vàng được trồng tại tỉnh Champasak - Lào - Nghệ vàng được thu hoạch vào tháng 10/2014 và tháng 4/2015 - Tên khoa học: Curcuma longa L.

- Tên gọi khác: Nghệ vàng, Khương hoàng, Uất kim, Cohem, Co khản mỉn(Thái), Khinh lương (Tày)

-Theo tiếng Anh: Long turmeric

- Một số hình ảnh nơi thu mua nghệ vàng ở Lào. Hình 2.1; 2.2; 2.3

Hình 2.1. Cổng Chợ Dao Heuang (Đao Hương), huyện Pakse, tỉnh ChamPasak

Hình 2.2. Bên trong Chợ Dao Heuang (Đao Hương), huyện Pakse

Hình 2.3. Nơi bày bán nghệ vàng trong Chợ Dao Heuang (Đao Hương), huyện Pakse.

b. Xử lý nguyên liệu

Củ nghệ vàng sau khi thu hoạch được loại bỏ củ hư, rửa sạch, cắt lát mỏng để xác định độ ẩm. Phần còn lại đem làm khô dưới ánh nắng mặt trời, xay mịn

và bảo quản trong bình thủy tinh kín, được thể hiện ở các hình 2.4; 2.5.

Hình 2.4. Củ nghệ vàng rửa sạch

Hình 2.5. Củ nghệ vàng phơi khô, xay nhỏ

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

a.Thiết bị, dụng cụ

- Bộ chiết Soxhlet 250ml

- Bộ chiết tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước - Bình cầu 250ml

- Bếp điện - Cân phân tích

27 - Ống đong 100ml - Chén nung - Bình hút ẩm - Giấy lọc - Muỗng

- Bình tam giác nút mài - Ống sừng bò

- Ống sinh hàn - Tủ sấy

- Lò nung

- Máy đo UV-VIS, quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, sắc kí khí -khối phổ (GC –MS) tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II, số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng.

b. Hóa chất

- Các dung môi hữu cơ: n-hexane, ethylacetaet, methanol, dichloromethane

- Hóa chất vô cơ: dung dịch HNO3 loãng, nước cất, ...

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý a. Độ ẩm của củ nghệ và mẫu nghệ * Cơ sở lý thuyết:

Xác định độ ẩm, hàm lượng tro dựa trên phép phân tích trọng lượng đây là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân khối lượng của sản phẩm, hình thành sau phản ứng kết tủa bằng phương pháp hoá học hay bằng phương pháp vật lý. Do chất phân tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối lượng của sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phân tích.

* Tiến hành:

Chuẩn bị 5 chén sứ, đánh số, rửa sạch, sấy trong tủ sấy ở 70oC. Sau một thời gian đặt vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng sau đó cân trên cân phân tích, tiến hành làm nhiều lần đến khi khối lượng không đổi mo. Bỏ một lượng nghệ vào các chén sứ, rồi cân lại trên cân phân tích được khối lượng m1, sau đó bỏ vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 70oC. Sau 4 tiếng lấy chén sứ ra để vào bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi tiến hành cân trên cân phân tích, rồi tiếp tục để chén sứ vào lại tủ sấy. Tiếp theo 1 tiếng lại tiếp tục lấy ra bỏ vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ phòng và cân trên cân phân tích, lặp lại nhiều lần đến khi cân khối lượng không đổi ta được m2.

Hàm lượng % ẩm được tính theo công thức:

1 2 W m m 100% (%) m    (2.1)

Trong đó: - m: khối lượng mẫu nghệ = m1 – m0 - W(%): độ ẩm của mỗi mẫu.

b. Hàm lượng tro trong mẫu nghệ

Để xác định hàm lượng tro người ta thường dùng các phương pháp tro hóa mẫu.

Các mẫu sau khi được xác định độ ẩm được tiến hành tiếp tục tro hóa mẫu. Mẫu sau khi sấy được đốt trên bếp điện để than hóa sơ bộ, sau khi mẫu đã chuyển sang dạng than đen đưa mẫu vào lò nung và tiến hành tro hóa ở nhiệt độ 600oC trong 8 tiếng đến khi thu được tro trắng.

Sau 8 tiếng lấy mẫu ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân trên cân phân tích, lặp lại nhiều lần đến khi khối lượng không đổi ta được khối lượng m3.

29 4 (%) m .100% H m  (2.2)

Trong đó: m4: khối lượng tro; m4 = m3 – mo

m3: khối lượng chén sứ + khối lượng tro H(%): hàm lượng tro của mẫu

2.2.2. Xác định hàm lượng kim loại trong củ nghệ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.

a. Cơ sở lý thuyết

Cơ sở lý thuyết của phép đo là dựa vào khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ cộng hưởng của nguyên tử ở trạng thái tự do. Đối với mỗi nguyên tố vạch cộng hưởng thường là vạch quang phổ nhạy nhất của phổ phát xạ nguyên tử của chính nguyên tử đó. Thông thường thì khi hấp thụ bức xạ cộng hưởng, nguyên tử sẽ chuyển từ trạng thái ứng với mức năng lượng cơ bản sang mức năng lượng cao hơn ở gần mức năng lượng cơ bản nhất, thường gọi là bước chuyển cộng hưởng.

b. Tiến hành

Thiết bị đo hàm lượng kim loại được mô tả ở Hình 2.6

Hình 2.6. Thiết bị đo hàm lượng kim loại

Xác đinh Pb, Cd theo phương pháp AOAC 999.10; 11 (2010)

- Có thể sấy khô mẫu trước bằng tủ sấy ở 1000C để tránh mẫu bị bắn khi cô ở bếp điện, sau đó đốt mẫu ở bếp điện đến than hóa.

- Đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ < 1000C, nâng từ từ nhiệt độ đến 4500C (tốc độ nâng nhiệt 500C/ h), giữ ở nhiệt độ này trong khoảng từ 6-8 giờ (phụ thuộc vào từng nền mẫu, sao cho mẫu được tro hoá đến màu trắng).

- Lấy chén nung ra khỏi lò, làm nguội đến nhiệt độ phòng, nếu tro chưa trắng thì thêm vào mẫu 1ml-2ml dung dịch HNO3 0,1M, đun trên bếp điện đến khô, hết axit, đưa vào lò nung, tiếp tục nung đến tro trắng.

- Tẩm ướt mẫu bằng vài giọt nước cất, thêm 5ml dung dịch HCl 1:1, cô canh cho hết axit trên bếp điện, hòa tan cặn bằng 15ml HNO3 0,1M, chuyển mẫu vào bình định mức 25ml và định mức đến vạch bằng dung dịch axit HNO3 0,1M. Dung dịch này dùng để đo trên máy AAS.

- Thiết bị phân tích máy AAS-GF 600, chế độ lò graphit, hãng sản xuất PERKIN-EMKER, Mỹ.

Xác định As theo phương pháp AOAC 986.15 (2010)

- Cân khoảng 5 – 10g mẫu (đối với mẫu dạng rắn). thấm ướt mẫu bằng 5ml Mg(NO3)2 7,5%, sấy khô, đốt trên bếp cách điện đến khi than hóa, đặt vào lò nung nâng nhiệt từ từ đến 4500C (tốc độ nâng nhiệt 500C/h) đến khi tro hóa hoàn toàn.

- Hòa tan tro vào bình định mức 25ml bằng dung dịch HCl 3M. Dung dịch này được dùng để đo trên bộ hóa hơi máy AAS.

- Đo trên thiết bị AAS Zeenit 700, hãng sản xuất Analytik Jena.

Xách định Hg theo phương pháp AOAC 971.21 (2010)

- Cân khoảng 0,5g mẫu (đối với mẫu rắn) hoặc 1 đến 2g mẫu ( đối với mẫu ướt) vào ống vô cơ hóa mẫu.

- Thêm vào ống mẫu 5ml axit HNO3 đậm đặc, 2ml H2O2 30%, lắc đều mẫu. - Lắp ống mẫu vào roto lò vi sóng (vị trị các ống mẫu phải ðối xứng, ðýa lỗ thoát hõi ra ngoài, miếng ðệm an toàn và nắp phải khô ráo).

- Làm ống mẫu trắng với điều kiện như mẫu nhưng không có mẫu. - Đặt chương trình theo catalogue của lò vi sóng.

- Kết thúc chương trình vô cơ hóa mẫu, phải làm nguội trước khi mở ống vô cơ hóa mẫu.

- Chuyển mẫu trong ống sau khi pha xong vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất. Lắc đều, lọc nếu có cặn lơ lửng. Dung dịch này được dùng để đo trên bộ hóa hơi lạnh máy AAS.

- Đo trên thiết bị AAS Zeenit 700, hãng sản xuất Analytik Jena.

2.3. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài, tôi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ thực nghiệm như Hình 2.7 và 2.8

Hình 2.7. Sơ đồ thực nghiệm theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.

Đo GC - MS

Thu tinh dầu

Giã nhỏ

Thử hoạt tính sinh học Nguyên liệu:

Rễ củ nghệ tươi

Tạo mẫu nguyên liệu tuơi

Bã Làm sạch

Hình 2.8. Sơ đồ thực nghiệm chiết soxhlet với các dung môi hữu cơ

2.4. KHẢO SÁT CHIẾT THU TINH DẦUBẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC

2.4.1. Khảo sát tỷ lệ rắn/lỏng

Cân 100g rễ củ nghệ tươi đã giã nhỏ, tiến hành chiết lần lượt với các thể tích nước là 100ml, 200ml, 300ml, 400ml, 500ml trong thời gian 2 giờ.

Công thức tính phần trăm tinh dầu:

% tinhdaàu .100 ngheätöôi V tinh daàu m  (2.3 )

2.4.2. Khảo sát thời gian chưng cất

Cân 100g rễ củ nghệ tươi đã giã nhỏ, tiến hành chưng chất 300ml nước. Tiến hành quan sát lượng tinh dầu thu được theo thời gian là 2giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ và 7 giờ

2.4.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá và thử hoạt tính sinh họccủa các chất có trong tinh dầu

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH).

- Thử hoạt tính kháng khuẩn với các chủng loại vi khuẩn là Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enteric, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, nấm Candida albicans.

Tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.5. QUI TRÌNH CHIẾT SOXHLET VỚI CÁC DUNG MÔI HỮU CƠ

- Chuẩn bị bộ chiết Soxhlet 250ml, rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô.

- Cân chính xác khoảng 10g bột rễ củ nghệ vàng, gói bằng giấy lọc (không bọc trong vải vì trong quá trình chiết sẽ sinh ra tạp chất) được khâu kín 4 mặt, ta có m1, rồi cho vào thiết bị chiết của bộ chiết soxlhlet. Đong chính xác 150ml dung môi chiết cho vào bình cầu. Tiến hành lắp dụng cụ, sau đó tiến hành chiết soxhlet song song với bốn loại dung môi hữu cơ là n-hexane,