6. Bố cục luận văn
1.6. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.6.1. Phương pháp chiết lỏng–lỏng
a. Nguyên tắc và điều kiện
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chấtphân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi
này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết. Và thế hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của quá trình chiết và tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường axit. Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, kiểu tĩnh được ứng dụng nhiều hơn vì sự đơn giản của nó.
Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây.
– Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu.
– Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
– Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được triệt để. – Cân bằng chiết nhanh đạt được và thuận nghịch, để giải chiết được tốt. – Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha. – Phải chọn môi trường axit, pH, loại axit thích hợp.
– Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình. – Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra được tốt.
b. Các phương pháp chiết lỏng-lỏng
* Phương pháp chiết tĩnh
Phương pháp chiết này đơn giản, không cần máy móc phức tạp, mà chỉ cần một số phễu chiết (dung tích 100ml, 250ml, 500ml) là có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay hay bằng máy lắc nhỏ. Tất nhiên khi phải làm hàng loạt mẫu thì mất nhiều thời gian. Hiện nay người ta có cung cấp các hệ chiết đơn giản có 6, 9 hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện chiết cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện chiết.
* Phương pháp chiết dòng liên tục
Trong phương pháp chiết này, khi thực hiện chiết, hai pha lỏng không trộn được vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất chất phân tích) được bơm liên
tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết như phễu chiết hay bình chiết liên hoàn đóng kín để chúng tiếp xúc với nhau. Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, cần một pha đứng yên trong bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tích chất của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Chiết theo cách này hiệu suất cao. Đây là phương pháp chiết được ứng dụng trong chiết sản xuất công nghệ. Để thực hiện cách chiết này, phải có hệ thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất hay cả hai chất chuyển động ngược chiều nhau và phải có bộ tách pha để tách các chất ngay trong quá trình chiết, lấy được chất chiết ra liên tục hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định mà cân bằng chiết đạt được [10].
1.6.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Phương pháp này được Izmailop và Schereiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi.
a. Nguyên tắc
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng các hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả là ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b
Trong đó:
a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
b : khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên. Nó cũng được các nhà hóa học tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được trong phản ứng.
Nhược điểm của kỹ thuật:
– Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển. – Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi.
– Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn.
b. Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử
Tủ hút hơi độc, đèn tử ngoại, máy sấy, bản mỏng, dụng cụ để phun thuốc thử, bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín, micropipet nhiều cỡ từ 1 ml đến 20ml hoặc các ống mao quản.
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuaric): cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1,2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi pha được đựng trong bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín.
c. Lựa chọn dung môi giải ly
Chọn dung môi triển khai phụ thuộc vào mẫu cần tách. Với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến phân cực.
Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng nhau, đều nhau trên cùng một bản mỏng, các vết chấm cách nhau 1 cm. Dùng những vi quản để đưa các dung môi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết mẫu một loại dung môi khác nhau. Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo thành vòng tròn. Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi. Quan sát các vòng tròn đồng tâm: dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực, dung môi nào vẫn nằm tại chỗ là dung môi đó không đủ phân cực.
Để dễ quan sát hơn, nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc ký bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân cực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, methanol. Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau rồi nhúng mỗi tấm vào một bình như đã chuẩn bị. Ghi nhận độ di động của các cấu tử trong mẫu:
– Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì dung môi đó chưa đủ phân cực (dung môi không phù hợp).
– Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực (dung môi không phù hợp).
–Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung môi đó phù hợp.
– Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống dung môi đơn không có những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi.
d. Chấm bản
Trước khi chấm mẫu lên bản phải dùng bút chì vót nhọn vạch đường mức xuất phát cách đáy khoảng 1cm và vạch đường kết thúc cách đầu bản 0,5cm.
Mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp. Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1mg mẫu đặt lên mặt kiếng đồng hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu với vài giọt dung môi dễ bay hơi như acetone. Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên trên bản mỏng tại một điểm cách đáy khoảng 1cm (điểm này
phải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).
Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏng để không nhìn thấy lỗ bề mặt. Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi về mặt thật nhanh để dung dịch thấm mẫu vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to. Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh, không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần để có vết đậm, rõ, đường kính không quá 2mm. Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu.
Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm.
e. Chuẩn bị bình triển khai
Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng một ít. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5–0,7cm.
Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5–10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình nhờ vào lớp giấy lọc.
Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào dung môi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để hai cạnh bên không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm.
Đậy nắp bình, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực mao dẫn. Theo dõi khi dung môi lên đến vạch kết thúc đã được vạch sẵn thì lấy bản ra khỏi bình. Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát bằng mắt và dùng bút chì khoanh nhẹ các vết thấy được. Còn nếu không thấy gì trên bản, có thể nhìn dưới đèn tử ngoại (UV), bằng hơi iod hoặc phun bản với thuốc thử hiện hình thích hợp.
Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường.
Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia tử ngoại. Ngoài ra có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ [10].
1.6.3. Phương pháp sắc ký cột
a. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn, tiếp theo cho cát phủ lên để có được một mặt bằng phẳng.
Chất hấp thu dạng sệt được chuẩn bị như sau:
Trong một becher đã có sẵn dung môi, cho chất hấp thu vào becher đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lưu ý không được thực hiện ngược lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không được quá loãng.
Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa bên dưới cột để dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại trên đầu cột.
Tiếp tục rót hỗn hợp chất hấp thu vào cột đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng thanh cao su gõ nhẹ vào ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt lớp chất hấp thu để làm xáo một phần chất hấp thu trên đầu cột, để yên cho chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng.
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột qua phễu thủy tinh có đuôi dài. Cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao 2cm trong cột thì mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu ở trong cột có dạng đồng nhất.
c. Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Trong bình cầu để cô quay chân không, mẫu cần sắc ký được hòa tan trong dung môi thích hợp, cho thêm silicagel vào từ từ một lượng vừa đủ và trộn đều. Hỗn hợp này được cô quay chân không cho đến khi bột silicagel khô, khi đó mẫu cần sắc ký sẽ được gắn chặt lên bề mặt hạt silicagel.
Đặt mẫu bột khô lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột) cho lên đầu cột để thấm ướt phần bột mẫu khô, cho thêm một lớp silicagel sạch lên trên mặt thoáng của mẫu để bảo vệ bề mặt mẫu. Cho dung môi giải ly vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
d. Dung môi giải ly
Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỷ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn.
Giải ly có nồng độ tăng dần: đôi khi việc sử dụng một dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn lấy chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn.Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm. Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm nứt cột. Cột nứt sẽ làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được.
e. Theo dõi quá trình giải ly
Hứng dung dịch giải ly trong các bình nhỏ có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một