6. Bố cục luận văn
1.6.4. Phương pháp định tính thành phần nhóm chức
a) Định tính alkaloid
* Thuốc thử Mayer
Hòa tan 1,36g HgCl2 trong 60ml nước cất và hòa tan 5g KI trong 10ml nước cất,hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
* Thuốc thửDragendorff
Hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25ml HNO3 30% (d=1,18). Hòa tan 28g KI và 1 ml HCl 6N trong 5ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch, để yên trong tủ lạnh 50C cho tủa màu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100ml. Dung dịch màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu được vài tuần.
Dung dịch acid loãng có chưa alkaloid đựng trong ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào ống nghiệm nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu camnâu. (Tủa alkaloid có thể thu hồi bằng cách xử lý với Na2CO3 và chiết với dietyl eter).
* Thuốc thử Wagner
Hòa tan 1,27g I2 và 2g KI trong 20ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
b) Định tính flavonoid
* Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ. Flavanon cho màu cam đến đỏ.
* Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ethanol
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong ethanol sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đến đỏ tím.
*Tác dụng với dung dịch 1% AlCl3/ethanol
Tùy theo số lượng, vị trí của các nhóm –OH, hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen.
c) Định tính steroid
* Phản ứng Salkowski
Hòa tan mẫu thử (1–2mg) trong chloroform (1ml) và nhỏ thêm vào H2SO4 đậm đặc (1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím.
* Phản ứng Rosenthaler
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong ethanol (2 giọt), HCl đậm đặc (1 giọt). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hoặc tím.
Dung dịch anhidrid acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu vào ở dạng rắn hoặc pha trong chloroform. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
d) Định tính glycosid
* Thuốc thử Keller–Killiani (Phản ứng đặc trưng của đường 2–deoxy)
Dung dịch thuốc thử: dung dịch 5% sulfat sắt Fe2(SO4)3 (1ml), acid acetic băng (99ml).
Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mới pha, H2SO4 đậm đặc (1–2 giọt). Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu xanh lục sau 1–2 phút.
* Thuốc thử Tollens (Phản ứng của đường khử)
Dung dịch thuốc thử: dung dịch AgNO3 10% (0,5ml), dung dịch 10% NaOH (0,5ml), thêm từng giọt NH4OH đến khi tan hết tủa.
Trong một ống nghiệm có chứa 1–2mg mẫu thử, thêm 5 giọt pyridin, 4 giọt thuốc thử mới pha. Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện gương bạc bám lên thành ống nghiệm hoặc có tủa màu đen Ag kim loại.
* Thuốc thử phenol–H2SO4 (Phản ứng của đường)
Dung dịch thuốc thử: phenol (5g), ethanol (95ml), H2SO4 đậm đặc (5ml). Chỉ sử dụng thuốc thử mới pha.
Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mới pha. Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu nâu.
e) Định tính lipid (chất béo)
* Tác dụng với dung dịch 50% H2SO4/methanol
Nhỏ dung dịch 50% H2SO4 vào một dung dịch lipid hòa tan trong methanol sẽ có màu nâu đen.
* Thuốc thử Glucose–Anilin
Glucose (2g) trong 20 ml nước cất, 2ml anilin trong 20ml ethanol, cho tất cả vào bình định mức và thêm buthanol vào cho đủ 100ml.
Nhỏ dung dịch thuốc thử Glucose–Anilin vào một dung dịch lipid sẽ có màu nâu.
* Tác dụng với hơi Iod
Phát hiện đơn giản nhưng không đặc trưng. Đặt bản mỏng vào bình kín, bão hòa bằng hơi iod, các vết lipid cho màu vàng đến nâu nhạt.
f) Định tính phenol
* Thuốc thử Bortrager (với KOH/methanol để phát hiện quinon, coumarin)
Nhỏ dung dịch thuốc thử 5% KOH trong methanol vào dung dịch có chứa quinon, coumarin sẽ có màu đỏ, tím hoặc xanh lục.
* Thuốc thử FeCl3
Nhỏ dung dịch thuốc thử FeCl3 trong nước hoặc trong ethanol vào dung dịch có chứa phenol sẽ có màu xanh dương đen.
* Thuốc thử Vanilin, HCl (để phát hiện catechol)
Nhỏ dung dịch thuốc thử 1% vanilin trong HCl đậm đặc vào dung dịch có chứa catechol sẽ có màu đỏ nâu.
g) Định tính tanin
* Thuốc thử gelatin mặn
Dung dịch NaCl (5g), gelatin (0,5g) hòa tan trong 100ml nước cất. Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa thành màu nâu.
* Thuốc thử Stiasny
Dung dịch formol 36% (20ml), HCl đậm đặc (10ml). Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ.
* Thuốc thử dung dịch 5% FeCl3/H2O
Nhỏ dung dịch thuốc thử FeCl3 trong nước vào dung dịch có chứa phenol sẽ có màu xanh dương đen.
h) Định tính Sesquiterpen lacton
Phản ứng dương tính có sesquiterpen lacton khi dung dịch có màu đỏ hoặc xanh dương.
* Thuốc thửAgNO3–NH4OH (để phát hiện các hợp chất lacton bất bão hòa α,β
hoặc β,γ)
Thuốc thử gồm 2 dung dịch, mỗi dung dịch được chứa riêng trong một chai: dung dịch 1 (dung dịch nước 0,1N AgNO3) và dung dịch 2 (dung dịch nước 5N NH4OH).
Lấy 2ml cao chiết, hòa tan trong ancol, nhỏ thêm 5 giọt dung dịch 1 và 5 giọt dung dịch 2, lắc nhẹ vài giây rồi để yên, sẽ thấy lớp gương bạc bám trên thành trong của ống nghiệm. Nếu không thấy phản ứng ở nhiệt độ thường thì nhúng ống nghiệm vào nước nóng.Đôi khi lớp gương bạc không hình thành vì ống nghiệm không sạch hoặc phản ứng chưa đủ, nhưng cho dù thế nào thì cũng có Ag kim loại bạc màu đen kết tủa dưới đáy ống nghiệm (đôi khi do hợp chất có hàm lượng thấp trong cao chiết, nên phải để qua đêm, sáng hôm sau mới thấy kết quả).
* Thuốc thử Baljet
Thuốc thử gồm 2 dung dịch, mỗi dung dịch được chứa riêng trong một chai: dung dịch 1 (dung dịch 1% acid picric trong metanol) và dung dịch 2 (dung dịch nước 10% NaOH).
Nhỏ mỗi dung dịch trên (2–3 giọt) vào 1ml dung dịch chứa mẫu thử. Kết quả dương tính là sau 5 phút dung dịch chuyển thành màu vàng cam đến đỏ đậm [10].
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Tua Sen được mua ở Hà Nội tháng 05/2017, sau đó xay dập, phân thành 2 mẫu (mẫu không đông lạnh và mẫu đông lạnh), tiến hành ngâm chiết với ethanol 800.
Hình 2.1. Mẫu tua Sen ngâm chiết với với ethanol 800
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. Thiết bị, dụng cụ
Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh, phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm khác.
Sắc ký bản mỏng, cột chạy sắc ký, bình triển khai, đèn UV bước sóng 254 và 365 nm, máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV–Vis LAMBDA25, máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, sắc ký khí ghép khối phổ GC–MS.
b. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc
1 n – hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc 2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Ethanol 96% 96% TCCS Việt Nam
4 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc 5 Dung dịch H2SO4 đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc
6 (Bi(NO3)3.H2O 98% TCCS Trung Quốc
8 Dung dịch HCl đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc
9 HgCl2 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
10 Dung dịch NaOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
11 AgNO3 99,8% TCCS Trung Quốc
12 Dung dịch NH4OH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
13 Vanillin Thương mại TCCS Việt Nam
14 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
15 Fe2(SO4)3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
16 CH3COOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
17 KOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
18 Dung dịch Formol 36%
Tinh khiết TCCS Trung Quốc
19 Na2SO4 rắn Tinh khiết TCCS Trung Quốc
20 Iot rắn Tinh khiết TCCS Trung Quốc
21 AlCl3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
22 Anhidrid acetic Tinh khiết TCCS Trung Quốc 21 Glucose rắn Tinh khiết TCCS Trung Quốc
22 Anilin Tinh khiết TCCS Trung Quốc
23 Silicagel Tinh khiết TCCS Đức
24 Phenol rắn Tinh khiết TCCS Trung Quốc
25 Gelatin Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2.2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm được trình bày ở hình 2.4.
Tua Sen
Làm sạch, phơi khô, nghiền Độ ẩm Xác định các
thông số hóa lý Mẫu tua Sen
đã qua xử lý sơ bộ Hàm lượng tro Hàm lượng kim loại
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 2.2.2. Xác định các thông số hóa lý
a. Độ ẩm
* Mục tiêu
Dược liệu (thực vật) thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì nguyên liệu dễ bị mốc, hư hỏng.
Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho nguyên liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản. Một số dược liệu cụ thể có thể có độ ẩm an toàn hay độ ẩm cho phép cao hơn hay thấp hơn [11].
* Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu [12].
* Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 chén sứ có kí hiệu sẵn, rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến nhiệt độ >1000 C. Sau khi sấy xong, lấy chén ra, bỏ vào bình hút ẩm, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân khối lượng các chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi ta được khối lượng m0 (g).
Cân m1(gam) khối lượng tua Sen. Cho vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 1050C trong thời gian 5h. Sấy xong lấy mẫu ra khỏi tủ, đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,005 g) ta được khối lượng m2 (g).
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 2 mẫu. * Cách tính độ ẩm
Độ ẩm của mỗi mẫu:𝑊(%) = (m0+ m1)−m2
m1 × 100%
Độ ẩm trung bình: 𝑊𝑇𝐵(%) = ∑ 𝑊 (%)21 2
Trong đó:
m0: khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m2 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). W(%) : độ ẩm của mỗi mẫu.
WTB(%) : độ ẩm trung bình.
b. Xác định hàm lượng tro
Xác định hàm lượng tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu. Đây là thành phần các chất vô cơ của dược liệu, nhưng cũng có thêm những tạp chất vô cơ (đất, cát…) lẫn vào dược liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau nên sẽ có thành phần vô cơ khác nhau [11].
* Nguyên tắc
Phá hủy hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 5250C±250C đến khối lượng không đổi [1].
* Cách tiến hành
Từ 2 mẫu đã được xác định độ ẩm ở thí nghiệm ở trên, tiếp tục đem đi than hóa trên bếp điện đến khi cháy thành than thì ngừng, tiếp theo cho mẫu vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 5000C trong thời gian 6h–10h cho đến khi thu được tro màu xám trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001 g) ta được khối lượng m3 (g).
* Cách tính hàm lượng tro
Hàm lượng tro của mỗi mẫu:𝐴(%) = m3−m0
m1 × 100%
Hàm lượng tro trung bình: 𝐴𝑇𝐵(%) = ∑ 𝐴(%)21 2
Trong đó:
m0: khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m3 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa mẫu (g) A(%) : hàm lượng tro của mỗi mẫu.
ATB(%): hàm lượng tro trung bình.
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS
Tùy theo điều kiện thổ nhưỡng mà lượng các kim loại nặng trong cây có thể thay đổi. Ở những vùng đất bị ô nhiễm, các dược liệu có thể có một lượng kim loại nặng rất cao có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng [11].
* Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hóa và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
* Cách tiến hành
Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch nước cường tan, lắc kĩ và lọc để loại bỏ tạp chất sau đó định mức bằng nước cất (bình định mức 100ml), đem xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [1].
* Tính toán kết quả: 𝑋 = 𝐶×𝑉
𝑚 × 𝐾
Trong đó:
X: hàm lượng kim loại trong mẫu (mg/kg).
C: hàm lượng kim loại đo được trên thiết bị (mg/l). V: thể tích định mức (ml).
K: hệ số pha loãng nếu có. M: khối lượng mẫu (g).
2.2.3. Ngâm dầm tạo tổng cao ethanol từ mẫu tua Sen
Lấy 700g mẫu tua Sen ngâm chiết bằng ethanol 800 ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 48 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuếch tán tốt. Lọc lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle. Ngâm chiết 3 lần, lần đầu dùng 7l ethanol những lần sau dùng 3,5l ethanol (bằng lượng thể tích dịch chiết lấy ra ở lần đầu). Gộp các dịch chiết và cất loại ethanol dưới áp suất giảm ta thu được cao ethanol của tua Sen.
Tiến hành ngâm chiết song song với 2 mẫu tua Sen đông lạnh và không đông lạnh. Cân xác định và so sánh khối lượng cao thu được giữa 2 mẫu tua Sen nghiên cứu.
Hình 2.2. Tổng cao ethanol thu được ở mẫu không đông lạnh (A1,2,3) và mẫu để
đông lạnh (B1,2,3) sau 3 lần ngâm chiết
2.2.4. Chiết phân bố lỏng–lỏng từ tổng cao ethanol
Cho vào 3 bình 10g cao ethanol hòa tan với 100ml nước cất, lắc kỹ để cao phân tán đều trong nước rồi chiết lỏng–lỏng với 3 dung môi n–hexane, dichloromethane và chloroform. Chiết song song, mỗi dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 150ml dung môi. Thời gian lắc chiết mỗi lần 2 giờ, sau đó chuyển ngay lên phễu chiết loại 250ml chờ tách lớp và chiết riêng phần dung môi, định mức các mẫu dịch chiết đến cùng thể tích, lấy 10ml cho vào vidal để làm mẫu đo UV–Vis. Gộp dịch chiết của cả 3 lần cô đuổi dung môi thu được cao n–hexane, dichloromethane và chloroform từ tổng cao ethanol. Cân khối lượng cao thu được và tính phần trăm khối lượng mỗi cao chiết so với khối lượng của tổng cao ethanol.
Hình 2.3. Chiết lỏng–lỏng với các dung môi n–hexane (1), dichloromethane (2) và
Hình 2.4. Dịch chiết thu được với 3 dung môi n–hexane, dichloromethane và
chloroform
Hình 2.5. Mẫu trích dịch chiết ethanol ở mẫu không đông lạnh (A1,2,3) và mẫu để
đông lạnh (B1,2,3) sau 3 lần ngâm chiết
Sau đó tiến hành định danh thành phần hóa học bằng phương pháp GC–MS.
2.2.5. Phân lập phân đoạn bằng sắc ký cột và sắc ký bản mỏng
Dùng 140g cao ethanol tua Sen chiết lỏng–lỏng với 2l dung môi dichloromethane (4 lần, mỗi lần 500ml dung môi), cô đuổi dung môi thu được 22,06g cao chiết dichloromethane.
Hình 2.6. Dịch chiết dichloromethane thu được sau khi chiết từ tổng cao ethanol
Tiến hành nhồi và ổn định cột sau đó nạp mẫu và chạy sắc ký cột với dung môi rửa giải phù hợp từ kết quả chấm bản mỏng.
Hình 2.7. Cột sắc ký sau khi được nhồi (1), nạp mẫu và bắt đầu rửa giải (2), trong
quá trình rửa giải (3,4,5)
Chuẩn bị bản mỏng, bình triển khai và bình hứng để thu dung dịch giải ly.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ
3.1.1. Độ ẩm
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của tua Sen khô được xác định và tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm của tua Sen
STT m1 (gam) m1 (gam) W(%)
1 49,785 47,009 5,58
2 48,831 46,292 5,20
Độ ẩm trung bình WTB(%) 5,39%
Nhận xét
Độ ẩm trung bình của tua Sen là 5,39%, đây là độ ẩm tương đối an toàn. Với độ