6. Bố cục luận văn
2.2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm được trình bày ở hình 2.4.
Tua Sen
Làm sạch, phơi khô, nghiền Độ ẩm Xác định các
thông số hóa lý Mẫu tua Sen
đã qua xử lý sơ bộ Hàm lượng tro Hàm lượng kim loại
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 2.2.2. Xác định các thông số hóa lý
a. Độ ẩm
* Mục tiêu
Dược liệu (thực vật) thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì nguyên liệu dễ bị mốc, hư hỏng.
Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho nguyên liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản. Một số dược liệu cụ thể có thể có độ ẩm an toàn hay độ ẩm cho phép cao hơn hay thấp hơn [11].
* Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu [12].
* Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 chén sứ có kí hiệu sẵn, rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến nhiệt độ >1000 C. Sau khi sấy xong, lấy chén ra, bỏ vào bình hút ẩm, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân khối lượng các chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi ta được khối lượng m0 (g).
Cân m1(gam) khối lượng tua Sen. Cho vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 1050C trong thời gian 5h. Sấy xong lấy mẫu ra khỏi tủ, đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,005 g) ta được khối lượng m2 (g).
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 2 mẫu. * Cách tính độ ẩm
Độ ẩm của mỗi mẫu:𝑊(%) = (m0+ m1)−m2
m1 × 100%
Độ ẩm trung bình: 𝑊𝑇𝐵(%) = ∑ 𝑊 (%)21 2
Trong đó:
m0: khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m2 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). W(%) : độ ẩm của mỗi mẫu.
WTB(%) : độ ẩm trung bình.
b. Xác định hàm lượng tro
Xác định hàm lượng tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu. Đây là thành phần các chất vô cơ của dược liệu, nhưng cũng có thêm những tạp chất vô cơ (đất, cát…) lẫn vào dược liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau nên sẽ có thành phần vô cơ khác nhau [11].
* Nguyên tắc
Phá hủy hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 5250C±250C đến khối lượng không đổi [1].
* Cách tiến hành
Từ 2 mẫu đã được xác định độ ẩm ở thí nghiệm ở trên, tiếp tục đem đi than hóa trên bếp điện đến khi cháy thành than thì ngừng, tiếp theo cho mẫu vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 5000C trong thời gian 6h–10h cho đến khi thu được tro màu xám trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001 g) ta được khối lượng m3 (g).
* Cách tính hàm lượng tro
Hàm lượng tro của mỗi mẫu:𝐴(%) = m3−m0
m1 × 100%
Hàm lượng tro trung bình: 𝐴𝑇𝐵(%) = ∑ 𝐴(%)21 2
Trong đó:
m0: khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m3 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa mẫu (g) A(%) : hàm lượng tro của mỗi mẫu.
ATB(%): hàm lượng tro trung bình.
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS
Tùy theo điều kiện thổ nhưỡng mà lượng các kim loại nặng trong cây có thể thay đổi. Ở những vùng đất bị ô nhiễm, các dược liệu có thể có một lượng kim loại nặng rất cao có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng [11].
* Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hóa và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
* Cách tiến hành
Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch nước cường tan, lắc kĩ và lọc để loại bỏ tạp chất sau đó định mức bằng nước cất (bình định mức 100ml), đem xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [1].
* Tính toán kết quả: 𝑋 = 𝐶×𝑉
𝑚 × 𝐾
Trong đó:
X: hàm lượng kim loại trong mẫu (mg/kg).
C: hàm lượng kim loại đo được trên thiết bị (mg/l). V: thể tích định mức (ml).
K: hệ số pha loãng nếu có. M: khối lượng mẫu (g).
2.2.3. Ngâm dầm tạo tổng cao ethanol từ mẫu tua Sen
Lấy 700g mẫu tua Sen ngâm chiết bằng ethanol 800 ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 48 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuếch tán tốt. Lọc lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle. Ngâm chiết 3 lần, lần đầu dùng 7l ethanol những lần sau dùng 3,5l ethanol (bằng lượng thể tích dịch chiết lấy ra ở lần đầu). Gộp các dịch chiết và cất loại ethanol dưới áp suất giảm ta thu được cao ethanol của tua Sen.
Tiến hành ngâm chiết song song với 2 mẫu tua Sen đông lạnh và không đông lạnh. Cân xác định và so sánh khối lượng cao thu được giữa 2 mẫu tua Sen nghiên cứu.
Hình 2.2. Tổng cao ethanol thu được ở mẫu không đông lạnh (A1,2,3) và mẫu để
đông lạnh (B1,2,3) sau 3 lần ngâm chiết
2.2.4. Chiết phân bố lỏng–lỏng từ tổng cao ethanol
Cho vào 3 bình 10g cao ethanol hòa tan với 100ml nước cất, lắc kỹ để cao phân tán đều trong nước rồi chiết lỏng–lỏng với 3 dung môi n–hexane, dichloromethane và chloroform. Chiết song song, mỗi dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 150ml dung môi. Thời gian lắc chiết mỗi lần 2 giờ, sau đó chuyển ngay lên phễu chiết loại 250ml chờ tách lớp và chiết riêng phần dung môi, định mức các mẫu dịch chiết đến cùng thể tích, lấy 10ml cho vào vidal để làm mẫu đo UV–Vis. Gộp dịch chiết của cả 3 lần cô đuổi dung môi thu được cao n–hexane, dichloromethane và chloroform từ tổng cao ethanol. Cân khối lượng cao thu được và tính phần trăm khối lượng mỗi cao chiết so với khối lượng của tổng cao ethanol.
Hình 2.3. Chiết lỏng–lỏng với các dung môi n–hexane (1), dichloromethane (2) và
Hình 2.4. Dịch chiết thu được với 3 dung môi n–hexane, dichloromethane và
chloroform
Hình 2.5. Mẫu trích dịch chiết ethanol ở mẫu không đông lạnh (A1,2,3) và mẫu để
đông lạnh (B1,2,3) sau 3 lần ngâm chiết
Sau đó tiến hành định danh thành phần hóa học bằng phương pháp GC–MS.
2.2.5. Phân lập phân đoạn bằng sắc ký cột và sắc ký bản mỏng
Dùng 140g cao ethanol tua Sen chiết lỏng–lỏng với 2l dung môi dichloromethane (4 lần, mỗi lần 500ml dung môi), cô đuổi dung môi thu được 22,06g cao chiết dichloromethane.
Hình 2.6. Dịch chiết dichloromethane thu được sau khi chiết từ tổng cao ethanol
Tiến hành nhồi và ổn định cột sau đó nạp mẫu và chạy sắc ký cột với dung môi rửa giải phù hợp từ kết quả chấm bản mỏng.
Hình 2.7. Cột sắc ký sau khi được nhồi (1), nạp mẫu và bắt đầu rửa giải (2), trong
quá trình rửa giải (3,4,5)
Chuẩn bị bản mỏng, bình triển khai và bình hứng để thu dung dịch giải ly.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ
3.1.1. Độ ẩm
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của tua Sen khô được xác định và tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm của tua Sen
STT m1 (gam) m1 (gam) W(%)
1 49,785 47,009 5,58
2 48,831 46,292 5,20
Độ ẩm trung bình WTB(%) 5,39%
Nhận xét
Độ ẩm trung bình của tua Sen là 5,39%, đây là độ ẩm tương đối an toàn. Với độ ẩm này, chúng ta có thể giữ được chất lượng tốt của nguyên liệu trong quá trình bảo quản tránh sự xâm hại của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và tổng hợp ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro của tua Sen
STT m1 (g) m1 (g) A(%)
1 47,009 39,015 17,00
2 46,292 38,288 17,29
Hàm lượng tro trung bình ATB(%) 17,15%
Nhận xét
Hàm lượng tro trung bình của tua Sen là 17,15%. Đây chính là hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi tồn tại trong tua Sen. Do điều kiện thổ nhưỡng ở những vùng khác nhau nên nguyên liệu sẽ có các thành phần vô cơ khác nhau.
3.1.3. Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS hấp thụ nguyên tử AAS
Hàm lượng của một số kim loại trong tua Sen được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng của tua Sen
STT Kim loại Kết quả
(mg/l) Hàm lượng cho phép (mg/l) 1 As 0.045 1 2 Pb 0,034 2 3 Cd 0,006 1 4 Hg 0,002 1 Nhận xét
Căn cứ quyết định của Bộ Y tế số 46/2007/QD – BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành qui định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm với hàm lượng các kim loại nặng cho phép trong thực phẩm (rau, quả, chè và các sản phẩm chè), chúng ta nhận thấy hàm lượng kim loại nặng có trong tua Sen thấp hơn so với hàm lượng tối đa cho phép. Do vậy, có thể sử dụng tua Sen trong dược liệu, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN NHÓM CHỨC
Mỗi nhóm chức định tính với 3 loại thuốc thử khác nhau: alkaloid (Mayer, Dragendorff,Wagner); flavonoid (H2SO4 đậm đặc, 1% NaOH/etanol, 1% AlCl3/etanol); steroid (Salkowski, Rosenthaler, Liberman–Burchard); glycosid (Keller–Killiani, Tollens, Phenol–H2SO4); lipid (50% H2SO4/metanol, Glycose– Anilin, hơi Iod); phenol (1% Vanilin + HCl đặc, 5% FeCl3/H2O, Bortrager); tannin (Gelatin mặn, Stiasny,5% FeCl3/H2O) và sesquiterpen–lacton (H2SO4 đậm đặc, 0,1N AgNO3 + 5N NH4OH, Baljet).
Tổng hợp kết quả định tính thành phần nhóm chức trong cao chiết cồn, n– hexane, dichloromethane và chloroform được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả định tính thành phần hóa học của tua Sen
ALKALOID FLAVONOID
Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Ethanol 800 – – – Ethanol 800 +++ + ++
n–hexane – – – n–hexane +++ +++ +
Dichlomethane – – – Dichlomethane + ++ +
Chloroform – – – Chloroform + ++ +
STEROID GLYCOSID
Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Ethanol 800 +++ – +++ Ethanol 800 +++ +++ ++
n–hexane +++ – ++ n–hexane – ++ –
Dichlomethane +++ – +++ Dichlomethane – +++ +++
Chloroform +++ + ++ Chloroform +++ – ++
LIPID SESQUITERPEN–LACTON
Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Cao chiết +++ ++ +
Ethanol 800 – – – Ethanol 800 +++ ++ +
n–hexane – – – n–hexane ++ ++ +++
Dichlomethane – – – Dichlomethane +++ – +
Chloroform – – – Chloroform +++ ++ +
TANIN PHENOL
Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Cao chiết TT 1 TT 2 TT 3 Ethanol 800 + – +++ Ethanol 800 + +++ ++
n–hexane ++ – +++ n–hexane – +++ +++
Dichlomethane + – +++ Dichlomethane – +++ ++
Nhận xét
Theo kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết ethanol của tua Sen có chứa các nhóm chức flavonoid, steroid, glycosid, phenol, tanin và sesquiterpen–lacton.
Ankaloid không có trong cao chiết ethanol và các phân đoạn tách ra từ tổng cao ethanol khi chiết với các dung môi n–hexane, dichlomethane và chloroform.
Lipid (chất béo) không xuất hiện trong thành phần cao chiết ethanol vì chất béo là hợp chất không phân cực nên không tan trong dung môi phân cực như ethanol.
3.3. KẾT QUẢ KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM CHIẾT VÀ CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM CHIẾT VÀ CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG
3.3.1. Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phương pháp ngâm chiết
Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phương pháp ngâm chiết được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khối lượng cao thu được sau khi cô quay các dịch chiết Mẫu Khối lượng sau
(g)
Khối lượng cốc (g)
Khối lượng cao (g) Tổng cao (g) BT – 1 166,208 108,145 58,063 BT – 2 151,715 121,352 30,363 BT – 3 118,613 100,159 18,454 ĐL – 1 179,378 120,180 59,198 ĐL – 2 162,002 129,982 32,020 ĐL – 3 130,280 141,776 17,504 106,88 0 108,72 2
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện tổng khối lượng cao chiết cồn mẫu không đông
lạnh và mẫu đông lạnh Nhận xét
Tổng cao chiết với ethanol 800 sau 3 lần chiết của mẫu không đông lạnh và mẫu đông lạnh lần lượt là 106,880 g và 108,722 g. Như vậy lượng cao chiết mẫu đông lạnh nhiều hơn mẫu đông lạnh
880 , 106 880 , 106 772 , 108 .100% = 1,77%.
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện khối lượng cao chiết cồn mẫu không đông lạnh
và mẫu đông lạnh qua 3 lần chiết
106.88 108.722 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Mẫu không đông lạnh Mẫu đông lạnh
K hố i lư ợng ( ga m ) 59.198 32.02 17.504 58.063 30.363 18.454 0 10 20 30 40 50 60 70 Lần 1 Lần 2 Lần 3 K h ối l ượ n g (ga m ) Số lần chiết Mẫu đông lạnh Mẫu không đông lạnh
Nhận xét
Qua 3 lần chiết nguyên liệu với dung môi ethanol 80% ta nhận thấy khối lượng cao chiết giảm rõ rệt. Ở lần chiết thứ 3, phần trăm chất chiết chỉ còn lại 16,10% (mẫu đông lạnh) và 17,27% (mẫu không đông lạnh). Do đó có thể dự đoán hầu hết các cấu tử đã được chiết ra.
Hình 3.3. Phổ UV–Vis dịch chiết ethanol của 2 mẫu không đông lạnh và đông lạnh
Nhận xét
Cực đại hấp phụ ở vùng bước sóng 200nm và không có sự khác biệt giữa 2 mẫu đông lạnh và không đông lạnh. Điều này chứng tỏ thành phần chất chiết là như nhau giữa 2 phương thức và giữa các lần chiết, sự khác nhau chủ yếu về lượng chất được chiết ra.
3.3.2. Kết quả chiết phân bố lỏng–lỏng tổng cao ethanol
Kết quả chiết phân bố lỏng–lỏng tổng cao ethanol được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khối lượng cao chiết, nhũ tương và cao nước Dung môi Khối lượng
cao chiết (g) Khối lượng nhũ tương (g) Khối lượng cao nước (g) % tổng cao n–hexane 1,949 3,455 4,544 19,5 dichloromethane 1,873 4,177 3,925 18,7 chloroform 1,585 4,884 3,430 15,9 190.0 200 220 240 260 280 300.0 0.00 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00 nm A
Dịch chiết mẫu không đông lạnh lần 1 Dịch chiết mẫu đông lạnh lần 1 Dịch chiết mẫu không đông lạnh lần 2 Dịch chiết mẫu đông lạnh lần 2 Dịch chiết mẫu không đông lạnh lần 3 Dịch chiết mẫu đông lạnh lần 3
Nhận xét
Khối lượng cao chiết từ tổng cao ethanol với dung môi n–hexane là lớn nhất 1,949g (19,5%), với dung môi dichloromethane và chloroform lần lượt là 1,873g (18,7%) và 1,585g (15,9%).
3.4. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ TỔNG CAO ETHANOL CỦA TUA SEN TỔNG CAO ETHANOL CỦA TUA SEN
3.4.1. Dịch chiết n–hexane
Sắc ký đồ GC của dịch chiết n–hexane từ tua Sen được thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của dịch chiết n–hexane từ tua Sen
Thành phần hóa học của dịch chiết bằng dung môi n–hexane đã được định danh trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Thành phần hóa học dịch chiết n–hexane STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pick (%)
Tên gọi – CTPT Công thức cấu tạo
1 16,44 5,95 cis-9-Hexadecanoic acid C16H30O2 O OH 2 16,77 10,18 Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O2 O O 3 20,15 9,35 Ethyl 9,12,15- octadecatrienoate C20H34O2 O O 4 20,90 31,19 9,12,15- Octadecatrienoic acid C18H30O2 OH O 5 27,91 3,40 1-Heneicosanol C21H44O OH 6 28,46 2,30 Hexadecanoic acid, 2- hydroxy-1- (hydroxymethyl)ethyl ester C19H38O4 OH O HO O 7 32,96 1,96 1-Heptacosanol C27H56O OH
8 33,81 1,39 3-Cyclohexene-1- methanol-α,α,4- trimethyl-,propanoate C13H22O2 O O 9 40,66 3,86 Campesterol C28H48O HO 10 41,58 4,67 9,19-Cycloergost- 24(28)-en-3-ol-4,14- dimethyl-,acetate C32H52O2 O O 11 41,96 7,33 β-Sitosterol C29H50O HO 12 43,07 8,72 9,19-Cyclolanost-24-en- 3-ol, acetate, (3α)- C32H52O2 O O 13 43,57 2,38 Cholest-4-en-3-one C27H44O O Nhận xét
Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy phương pháp GC–MS đã định danh được 13 cấu tử trong dịch chiết n–hexane từ tua Sen. Các cấu tử có hàm lượng cao > 5% là