CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. ĐIỀU CHẾ DUNG DỊCH KEO AGNP/WSC
2.2.1. Hóa chất thí nghiệm sử dụng
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại hóa chất tinh khiết, không cần qua tinh chế lại.
AgNO3 xuất xứ Trung Quốc
Chitosan hòa tan đã điều chế trên
Glutaraldehyde xuất xứ Trung Quốc
Nước cất 2 lần
2.2.2. Quy trình tổng hợp dung dịch keo và màng AgNP/Chitosan hòa tan
Có nhiều phương pháp khác nhau để điều chế AgNP, nhưng nhìn chung phương pháp phổ biến là khử ion bạc về bạc và tập hợp thành AgNP. Với mục tiêu ứng dụng màng AgNP-WSC cho mục đích y tế, nên sản phẩm đòi hỏi phải an toàn, không gây tác dụng phụ. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chitosan hòa tan vừa là chất khử, vừa là nền phân tán cho sản phẩm AgNP tạo thành.
Quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP-WSC có nồng độ AgNP ước tính 100 ppm (tính theo ion bạc) được tiến hành như sau:
- Cho vào lọ phản ứng 9 ml dung dịch WSC 1%, thêm tiếp từ từ 1ml dung dịch AgNO310mM. Hỗn hợp được khuấy đều trên máy khuấy từ với tốc
độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ và thời gian khảo sát. Màu hỗn hợp phản ứng chuyển dần từ không màu sang vàng đậm đến nâu sẫm, chứng tỏ có sự hình thành AgNP. Dung dịch keo AgNP-WSC được để nguội đến nhiệt độ phòng, lưu giữ ở 4o
C để thực hiện các bước khảo sát các đặc trưng vật lí, hóa học, sinh học tiếp theo.
- Tối ưu quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP 100 ppm được thực hiện thông qua khảo sát ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ phản ứng, pH dung dịch phản ứng và thời gian phản ứng.
a. Ảnh hưởng của thời gian
Phản ứng được tiến hành trong ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát ở trên trong khoảng thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút ở pH trung tính. Tốc độ khuấy được giữ nguyên không đổi 200 vòng/phút trong suốt quá trình phản ứng.
b. Ảnh hưởng của pH
pH của dung dịch phản ứng được hiệu chỉnh bằng dung dịch H2SO4 loãng hoặc NaOH loãng trong khoảng nghiên cứu từ 5 đến 8. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã khảo sát ở trên. Cũng cần lưu ý đảm bảo tốc độ khuấy được giữ nguyên không đổi 200 vòng/phút trong suốt quá trình phản ứng.
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng điều chế AgNP được tiến hành tại pH trung tính sau 2 giờ phản ứng theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.2. Nhiệt độ phản ứng khảo sát được thay đổi từ 30oC – 70oC. Tốc độ khuấy được giữ nguyên không đổi 200 vòng/phút trong suốt quá trình phản ứng.
Màng AgNP-WSC được tạo ra bằng cách nhỏ dung dịch keo AgNP/WCS (có bổ sung thêm glutaraldehyde 0.01% để làm tác nhân khâu mạch) lên trên khuôn phẳng có phủ Teflon. Màng đươc đóng rắn ở nhiệt độ phòng, được làm khô qua đêm trong tủ sấy chân không ở 40oC.
2.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƢNG VẬT LÍ, HÓA HỌC, SINH HỌC CỦA SẢN PHẨM AgNP/WSC
2.3.1. Đặc trƣng cộng hƣởng plasmon của hạt keo AgNP
Đo tín hiệu cộng hưởng plasmon bề mặt là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định đặc trưng về kích thước của hạt nano vàng, bạc bằng cách sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong vùng UV-Vis.
Bản chất của phổ hấp thụ không phải do sự dịch chuyển giữa các mức năng lượng mà là do hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt xuất hiện khi kích thước của một tinh thể nano kim loại nhỏ hơn bước sóng của bức xạ tới. Đây là sự kích thích các electron tự do bên trong vùng dẫn, dẫn tới sự hình thành các dao động đồng pha.
Theo tính toán của Mie[25], đối với các hạt hình cầu, vị trí đỉnh cộng hưởng plasmon phụ thuộc vào ba yếu tố cơ bản:
Hình dạng, kích thước của hạt nano.
Bản chất của vật liệu (phụ thuộc vào hằng số điện môi của vật liệu).
Môi trường xung quanh kim loại đó.
Như vậy, hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt có xảy ra với các hạt keo AgNP. Hiện tượng này tạo nên màu sắc của dung dịch keo AgNP từ vàng nhạt đến nâu đen do có sự thay đổi nồng độ và kích thước hạt.
Phổ cộng hưởng plasmon bề mặt của các hạt AgNP được xác định bằng cách đo quang phổ hấp thụ UV-Vis trong khoảng bước sóng từ 350 - 800 nm. Mẫu đo được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch AgNP đã điều chế với nước cất 2 lần theo tỉ lệ thể tích AgNP : H2O = 1 : 2. Hỗn hợp được cho vào cuvet và ghi lại phổ trên máy đo quang phổ hấp thụ UV- Vis ở nhiệt độ phòng. Mẫu nền so sánh chính là dung dịch chitosan hòa tan có nồng độ tương đương với nồng độ WSC có trong mẫu đo.
2.3.2. Phân tích cấu trúc tinh thể của hạt keo AgNP
Cấu trúc tinh thể của vật liệu AgNP đã tổng hợp được xác định thông qua phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X. Phương pháp này cho phép xác định hằng số mạng và các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng cho các cấu trúc của vật liệu. Đối với kim loại, phương pháp này còn cho phép các xác định chính xác sự tồn tại của kim loại trong mẫu dựa trên các đỉnh nhiễu xạ thu được khi so sánh với các đỉnh nhiễu xạ chuẩn của nguyên tố đó[22].
Cấu trúc tinh thể của các hạt AgNP được xác định bằng nhiễu xạ tia X trên máy Bruker AXS D8 Advance. Dung d ịch keo AgNP-WSC được li tâm với tốc độ cao, thu lấy phần không tan, sấy khô, sau đó tiến hành đo nhiễu xạ tia X.
2.3.3. Phân tích xác định kích thƣớc và hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Hình dạng và kích thước của các hạt AgNP trong nền WSC được xác định thông qua chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có độ phân giải cao trên máy JEOL JEM 1100 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Mẫu AgNP sau khi li tâm, tách loại khỏi nền WSC, được phân tán trong dung môi ethanol. Mẫu được cố định vật lí trên tấm lưới đồng, làm khô qua đêm trước khi tiến hành phân tích đặc trưng hình dạng và kích thước.
2.3.4. Phân tích đặc trƣng cấu trúc của sảm phẩm chitosan và AgNP-WSC
Đặc trưng sản phẩm WSC và AgNP-WSC được xác định thông qua phân tích phổ hồng ngoại FT-IR trên máy trong vùng bước sóng từ 400 ÷ 4000 cm-1 để thu được những thông tin quan trọng về dao động đặc trưng của các nhóm chức có mặt trong phân tử chất phân tích, từ đó có được các thông tin về cấu trúc của phân tử.
thạch anh để tạo hỗn hợp bột mịn, đồng nhất. Bột này sau đó được ép thành màng và ghi lại phổ hồng ngoại ở nhiệt độ phòng. Từ các pic đặc trưng xuất hiện trên giản đồ, có thể xác định được sự có mặt của các nhóm chức.
2.3.5. Phân tích xác định thành phần
Thành phần định tính cũng như định lượng của các nguyên tố có mặt trong mẫu nghiên cứu được xác định thông qua việc đo phổ tán sắc năng lượng tia X.
Phép đo được thực hiện trên mẫu nghiên cứu đã được sấy khô trên máy
2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AgNP-WSC
Tính kháng khuẩn của hỗn hợp vật liệu AgNP-WSC được đánh giá thông qua khả năng ức chế của nó đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-)Escherichia coli (E. Coli) và Gram (+)Staphylococcus aureus (S. aure) bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên môi trường nuôi cấy agarose. Màng được đặt trên nền dinh dưỡng agarose đã được cấy vi khuẩn nghiên cứu và ủ ở 37o
C trong vòng 24 giờ. Sau đó, dùng thước đo đường kính vòng ức chế để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu chế tạo. Đường kính vòng ức chế càng rộng thì khả năng ức chế của màng với vi sinh vật đó càng hiệu quả.
Thử nghiệm đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của mẫu được tiến hành qua các bước sau
2.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sử dụng là thạch Mueller-Hinton (Merk) được chuẩn bị theo các bước sau:
- Cân một lượng chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất, hòa tan vào nước cất 2 lần, đun sôi để thạch tan hoàn toàn.
- Kiểm tra giá trị pH nằm trong khoảng 7.1±0.2. Nếu pH nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng axit hoặc kiềm, mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại môi trường khác.
- Hấp tiệt trùng môi trường thạch ở 1210C trong 15 phút, để nguội môi trường tới 50°C.
- Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch). Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.
2.4.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng AgNP-WSC được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa với hai chủng vi khuẩn gốc Escherichia coli (E. Coli) và Staphylococcus aureus (S. aureus) được cung cấp từ Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đà Nẵng và lưu giữ tại Phòng Vi sinh, Bệnh viện Quân Y 17. Quy trình được thể hiện ở Sơ đồ 2.2.
- Tạo khuẩn lạc đơn: Trước 1 ngày thử nghiệm, mỗi chủng vi khuẩn được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế và ủ các đĩa thạch ở 37°C trong vòng 24 giờ trong tủ ấm để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí: Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lí NaCl 0.9 % vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex.
- Cấy trải vi khuẩn lên đĩa thạch được thực hiện ngay trên huyền dịch đã chuẩn bị, láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton chứa trong đĩa petri và hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt mẫu nghiên cứu.
- Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy vô trùng lên đĩa thạch trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch. Tẩm ướt mẫu nghiên cứu (AgNP 100 ppm) lên mỗi khoanh giấy, sau đó để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các dung dịch từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm ở 37°C trong vòng 24 giờ.
- Đo vòng kháng khuẩn: Lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm, đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước kẻ đến đơn vị milimet.
- Phân tích kết quả: Dựa vào sự xuất hiện vòng kháng khuẩn để đánh giá các dung dịch có kháng khuẩn hay không đối với mỗi chủng vi khuẩn thử. Nếu xuất hiện vòng kháng khuẩn bao quanh khoanh giấy kháng sinh, chứng tỏ dung dịch được tẩm lên khoanh giấy có khả năng kháng khuẩn. Đường kính vòng kháng khuẩn càng lớn tương ứng với khả năng ức chế chủng vi khuẩn càng cao.
Sơ đồ 2.2. Quy trình thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khu n của màng AgNP-WSC
2.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TRỊ BỎNG CỦA VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Khả năng trị bỏng của hỗn hợp vật liệu AgNP-WSC đã điều chế ở trên được thực hiện trên thỏ đã trưởng thành, có khối lượng 2 kg/con. Thỏ được nuôi trong điều kiện chuồng khô ráo, sạch với nguồn thức ăn được đảm bảo không nhiễm khuẩn. Tiến hành thực nghiệm đánh giá khả năng trị bỏng của tổ hợp vật liệu AgNP-WSC được thực hiện theo tiêu chuẩn qua các bước sau
Bước 1. Thỏ được cạo lông tại vị tró gây bỏng trên lưng
Bước 2. Dùng mảnh thép có tiết diện (1 × 1) cm2 được đốt trên đèn cồn gây bỏng 3 vết như nhau trên vùng cạo lông, sau đó đánh dấu các vết bỏng theo thứ tự (a), (b), (c)
+ Vết (a). Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên. + Vết (b). Sử dụng WSC được hòa tan trong nước bôi lên vết thương bỏng. + Vết (c). Sử dụng hỗn hợp vật liệu AgNP- WSC bôi lên vết thương bỏng Quan sát quá trình phục hồi vết thương theo thời gian, đánh giá khả năng trị bỏng của nó dựa vào diễn biến sinh lí của vết bỏng, ta có thể đánh giá tình trạng vết thương bỏng thông qua quá trình tái tạo mô. Hiệu quả điều trị bỏng được đánh giá dựa vào các đặc điểm chung của vết bỏng như mức độ phù nề, sung huyết, tiết dịch, tình trạng loét, hoại tử vết thương.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐIỀU CHẾ CHITOSAN HÒA TAN
Phản ứng điều chế WSC được thực hiện bằng phương pháp cắt mạch chitosan với tác nhân oxi hóa H2O2. Phản ứng cắt mạch diễn ra sẽ làm giảm khối lượng phân tử của chitosan, dẫn đến khả năng hòa tan dễ dàng hơn của chitosantrong môi trường nước. Nếu mạch quá ngắn, chitosan sẽ hòa tan nhiều trong nước, khó kết tinh trở lại và không thể tạo màng. Tuy nhiên, nếu mạch chitosan quá dài, khả năng hòa tan là không thể thực hiện được. Các kết quả nghiên cứu trước của Nhóm nghiên cứu cho thấy nhiệt độ, thời gian phản ứng và nồng độ H2O2 đều ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình cắt mạch chitosan tạo WSC. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá trình điều chế bằng việc khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố nồng độ H2O2, nhiệt độ và thời gian phản ứng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần, trong đó mọi tổ hợp các mức của các yếu tố đều được thực hiện để nghiên cứu.
Tiến hành khảo sát trong các mức trên và dưới của các yếu tố. Để đồng nhất, chúng tôi chuyển các mức yếu tố khảo sát từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ nguyên bằng phương pháp mã hóa như sau
Yếu tố Mức trên Mức dƣới
Tự nhiên Mã hóa Tự nhiên Mã hóa
Nhiệt độ phản ứng (X1) 700C +1 300C -1 Nồng độ H2O2 (X2) 6% +1 4% -1 Thời gian phản ứng (X3) 7 h +1 3h -1
Mô hình toán học biểu diễn đầy đủ ảnh hưởng có tương tác giữa các yếu tố đến hiệu suất của quá trình thu hồi chitosan như sau:
Y = b0 + b1X1+ b2X2+ b3X3+ b12X1X2+ b13X1X3+ b23X2X3
Theo đó, ma trận quy hoạch thí nghiệm mở rộng được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3. . Phương án sắp xếp thí nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm mở r ng Số TN X0 X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3 Y Y tính 1 1 1 1 1 1 1 1 25.38 30.02 2 1 -1 -1 1 1 -1 -1 15.34 16.80 3 1 1 -1 1 -1 1 -1 32.98 29.75 4 1 -1 1 1 -1 -1 1 34.25 31.38 5 1 1 1 -1 1 -1 -1 28.65 24.00 6 1 -1 -1 -1 1 1 1 12.25 10.79 7 1 1 -1 -1 -1 -1 1 20.5 23.73 8 1 -1 1 -1 -1 1 -1 22.5 25.37 9 - 0 0 0 29.59 10 - 0 0 0 31.25 11 - 0 0 0 28.85
Thí nghiệm tại tâm phương án được thực hiện 3 lần để xác định phương sai tái hiện với các mức yếu tố sau:
- Thời gian phản ứng: t = 5 giờ - Nhiệt độ phản ứng: t0 = 50oC - Nồng độ H2O2: C% = 5%
1 1 N ji i j i N b X Y ; ij 1 N ji i i N X Y b
Tính toán các giá trị hệ số trong phương trình hồi quy, thu được kết quả như sau:
b0 b1 b2 b3 b12 b13 b23
23.9825 2.89625 3.71375 3.00625 -3.57625 -0.70375 -0.88625
Kiểm định ý nghĩa của các hệ số hồi quy:
N S S S b t th bj bj j j 2 ; 1 3 ) ( 1 0 2 3 2 u u o th y y