CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AGNP-WSC
Tính kháng khuẩn của hỗn hợp vật liệu AgNP-WSC được đánh giá thông qua khả năng ức chế của nó đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-)Escherichia coli (E. Coli) và Gram (+)Staphylococcus aureus (S. aure) bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên môi trường nuôi cấy agarose. Màng được đặt trên nền dinh dưỡng agarose đã được cấy vi khuẩn nghiên cứu và ủ ở 37o
C trong vòng 24 giờ. Sau đó, dùng thước đo đường kính vòng ức chế để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu chế tạo. Đường kính vòng ức chế càng rộng thì khả năng ức chế của màng với vi sinh vật đó càng hiệu quả.
Thử nghiệm đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của mẫu được tiến hành qua các bước sau
2.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sử dụng là thạch Mueller-Hinton (Merk) được chuẩn bị theo các bước sau:
- Cân một lượng chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất, hòa tan vào nước cất 2 lần, đun sôi để thạch tan hoàn toàn.
- Kiểm tra giá trị pH nằm trong khoảng 7.1±0.2. Nếu pH nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng axit hoặc kiềm, mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại môi trường khác.
- Hấp tiệt trùng môi trường thạch ở 1210C trong 15 phút, để nguội môi trường tới 50°C.
- Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch). Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.
2.4.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng AgNP-WSC được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa với hai chủng vi khuẩn gốc Escherichia coli (E. Coli) và Staphylococcus aureus (S. aureus) được cung cấp từ Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đà Nẵng và lưu giữ tại Phòng Vi sinh, Bệnh viện Quân Y 17. Quy trình được thể hiện ở Sơ đồ 2.2.
- Tạo khuẩn lạc đơn: Trước 1 ngày thử nghiệm, mỗi chủng vi khuẩn được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế và ủ các đĩa thạch ở 37°C trong vòng 24 giờ trong tủ ấm để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí: Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lí NaCl 0.9 % vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex.
- Cấy trải vi khuẩn lên đĩa thạch được thực hiện ngay trên huyền dịch đã chuẩn bị, láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton chứa trong đĩa petri và hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt mẫu nghiên cứu.
- Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy vô trùng lên đĩa thạch trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch. Tẩm ướt mẫu nghiên cứu (AgNP 100 ppm) lên mỗi khoanh giấy, sau đó để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các dung dịch từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm ở 37°C trong vòng 24 giờ.
- Đo vòng kháng khuẩn: Lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm, đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước kẻ đến đơn vị milimet.
- Phân tích kết quả: Dựa vào sự xuất hiện vòng kháng khuẩn để đánh giá các dung dịch có kháng khuẩn hay không đối với mỗi chủng vi khuẩn thử. Nếu xuất hiện vòng kháng khuẩn bao quanh khoanh giấy kháng sinh, chứng tỏ dung dịch được tẩm lên khoanh giấy có khả năng kháng khuẩn. Đường kính vòng kháng khuẩn càng lớn tương ứng với khả năng ức chế chủng vi khuẩn càng cao.
Sơ đồ 2.2. Quy trình thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khu n của màng AgNP-WSC