CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng. Có nhiều kỹ thuật chiết như: chiết ngấm kiệt, chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết lôi cuốn hơi nước…
Đối với kỹ thuật chiết ngấm kiệt: mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexan, CHCl3, EtOAc và BuOH. Với mỗi loại dung môi được chiết ba lần. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu.
Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột cây) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép khơng rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng
bình bằng nhựa vì dung mơi hữu cơ có thể hịa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả.
Rót dung mơi tinh khiết (H2O, EtOH) vào bình cho đến bề mặt của lớp bột cây. Chiết mẫu ở nhiệt độ từ 800C – 900C. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc. Quá trình chiết được lặp lại nhiều lần, mỗi lần chiết khoảng 24h. Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không, thu được cao chiết tổng. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo lộn, xốc đều hoăc sử dụng máy siêu âm. Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n-hexan, chloroform, ethyl acetate và butanol bằng phễu chiết. Với mỗi loại dung môi thực hiện chiết 3 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao chiết BuOH, EtOAc, n-hexan) để tiếp tục nghiên cứu.
Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết ngâm dầm.
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung mơi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thường sử dụng silicagel pha thuận và pha đảo. Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc kí cột Sephadex LH–18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS trên máy GCMS 2010
plus-Shimadzutại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm Thừa Thiên Huế.
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, HSQC, HMBC. Các loại phổ được đo tại Viện Hoá học – Viện hàn lâm khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
2.3. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 2.3.1. Akaloid
Cân 5g bột hoa đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95 độ : NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, mơi trường phải có tính base. Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn.
Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung mơi đến cạn, thu được cặn. Hịa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, Đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc thử Mayer, Wagner.
Sau khi thử dịch chiết với:
Thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa vàng, phản ứng dương tính Thuốc thử Wagner: Xuất hiện kết tủa nâu, phản ứng dương tính