CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
ĐỰC
Định tính các lớp chất thiên nhiên trong hoa đu đủ đực bằng các phản ứng hóa học.
Kết quả định tính sơ bộ các lớp chất hóa học được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Định tính các lớp chất trong hoa Đu đủ đực STT Nhóm hợp chất Thuốc thử và phản ứng Kết quả Kết luận sơ bộ 1 Ankaloid Phản ứng với thuốc thử Mayer Wagner +++ ++ Có 2 Flavonoid H2SO4 đậm đặc NaOH 1%: + + Có 3 Coumarin Phản ứng mở đóng vịng lacton + Có
4 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Có
5 Đường khử Thuốc thử Fehling A và
thuốc thử Fehling B + Có 6 Polyphenol Dung dịch FeCl3 1% + Có
7 Steroid Phản ứng Libermann- Burchard Phản ứng Salkowski + + Có
8 Axit hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 tinh thể _ Không 9 Chất béo Để lại vết mờ trên tờ giấy lọc ++ Có
10 Carotene Phản ứng với H2SO4 + Có 11 Polysaccarid Thuốc thử Lugol + Có 12 Iriđoi Thuốc thử Trim-Hill _ Không
Ghi chú: Dấu (+++): Phản ứng rất rõ (++): Phản ứng rõ (+): Có phản ứng
(-): Khơng có phản ứng
KẾT LUẬN: Sau khi tiến hành định tính các nhóm hợp chất tự nhiên thì
trong hoa đu đủ đực có các hợp chất: alkaloid, flavonoid, saponin steroid, đường khử, polyphenol, sterol, coumarin, polysaccarid, carotene, chất béo.
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT CHLOROFROM TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
Các cao chiết chlorofrom đem thử hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dịng tế bào ung thư:
- phổi (A549) - gan (Hep3B) - vú (MCF-7).
Kết quả hoạt tính độc tế bào của các cao chiết chlorofrom được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết chloroform
Mẫu Nồng độ (µg/mL) TB sống sót (%) A549 Hep3B MCF-7 % TB sống Sai số % TB sống Sai số % TB sống Sai số Cont rol 100.00 2.40 100.00 1.89 100.00 3.76
Mẫu Nồng độ (µg/mL) TB sống sót (%) A549 Hep3B MCF-7 E/C 30 64.94 2.40 57.29 1.91 71.59 0.63 100 50.67 1.00 49.91 2.22 69.22 0.31 N/C 30 57.26 1.25 86.89 0.30 54.68 2.11 100 39.73 0.33 77.53 2.67 48.03 1.24 M/C 30 56.30 0.62 59.70 1.50 70.42 1.49 100 35.76 2.50 46.81 3.75 38.24 1.60 Cam ptoth ecin 0.5 µM 76.00 2.27 48.73 1.35 62.82 2.10 10 µM 41.77 1.25 28.27 2.64 42.66 2.08
Ký hiệu: E/C: phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng ethanol N/C: phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng nước M/C: phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng methanol
Kết luận: Các phân đoạn cao chiết chloroform của hoa đu đủ đực đều có
hoạt tính sinh học rất tốt trong kìm hãm các tế bào ưng thư phổi, gan, vú.Trong đó dịch chiết phân đoạn cao chloroform từ cao tổng methanol có hoạt tính tốt nhất. Cụ thể: phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng ethanol có tác dụng mạnh nhất trên tế bào ung thư gan (Hep 3B); phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng nước có tác dụng mạnh trên cả 2 dịng tế bào ung thư phổi (A549) và vú (MCF-7); phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng methanol (mẫu M/C)có tác dụng đối với cả 3 dòng tế bào ung thư (A549), gan (Hep 3B) và vú (MCF-7) với tỉ lệ phẩn trăm các tế bào sống sót đều dưới 50%.
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM HOA ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết chloroform hoa đu đủ đực được trình bày trong hình 3.1
Kết quả phân tích sắc kí đồ GC-MS và so sánh với thư viện chuẩn cho thấy có 9/9 cấu tử được định danh.
Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform hoa đu đủ đực được trình bày qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform hoa đu đủ đực
STT TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo
1 6,159 2,7 2-Pentanone, 4-hydroxy- 4methyl- C6H12O2 2 6,621 9,56 Ethylbenzene C8H10 3 6,852 5,29 Benzene, 1,3,dimethyl C8H10 4 12,087 2,78 D-Limonene C10H16 5 12,331 24,22 2(3H)-Furanone dihydro-3-hydroxy-4,4- dimetyl; C6H10O3
STT TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo 6 37,07 15,88 3,3,5,5- tetrametylcyclohexanol C10H20O 7 39,756 23,74 2H-Quinolizine-1- metanol, octahydro C10H19NO 8 42,609 7,51 4(1H)-pyrimidinone, 6-amino-2-metyl-5-nitroso C5H6N4O2 9 43,050 8,31 Glycyl-L-proline C7H12N2O3
Từ bảng 3.2 cho thấy, các cấu tử đã được định danh với hàm lượng lớn bao gồm: 2H-Quinolizine-1-metanol, octahydro (23,74%), 2(3H)- Furanonedihydro-3-hydroxy-4,4-dimetyl (24,22%); 3,3,5,5 tetrametylcyclohexanol(15,88%); Ethylbenzene(9,56%); Glycyl-L-proline (8,31%);4(1H)-pyrimidinone,6-amino-2-metyl-5-nitroso (7,51%); Benzene, 1,3,dimethyl (5,29% ), D-Limonene (2,78%); 2-Pentanone, 4-hydroxy- 4methyl (2,7%).
Hình ảnh phổ MS của các cấu tử chiếm tỉ lệ phần trăm diện tích peak lớn được trình bày trên các hình từ 3.2 đến 3.4.
Hình 3.2. Phổ MS của 2(3H)-Furanonedihydro-3-hydroxy-4,4-dimetyl
Hình 3.4. Phổ MS của 2H-Quinolizine-1-metanol, octahydro
3.4. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CHLOROFORM
Cấu trúc các hợp chất
Hợp chất C1
Hợp chất C1 thu được dưới dạng bột màu vàng sẫm. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện các píc tại m/z 287,14 [M+H]+, cho thấy giá trị M = 286, 14. Phổ 1H-NMR của C1 cho tín hiệu của 10 proton, Phổ 1C-NMR cho tín hiệu của 15 C. Các đặc trưng phổ của C1 cho phép dự đoán C1 là 1 flavonoid, CTPT là C15H10O6 phù hợp với công thức phân tử của kaempferol.
Hình 3.5. Phổ MS của C1
Trên phổ 1H-NMR của C1 xuất hiện hai tín hiệu singlet tại H 6,23 (1H, s) và H 6,42 (1H, s) đặc trưng cho proton vịng A tại vị trị C-6 và C-8; hai tín hiệu doublet tại H 8,07 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz) với
hằng số tích phân bằng 2 cho thấy vịng B bị thế tại C-4′.
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR-DEPT của C1
Trên phổ 13C-NMR và DEPT của C1 xuất hiện tín hiệu của 15 cacbon,
trong đó có 5 cacbon methine và 10 cacbon khơng liên kết trực tiếp với hidro (bảng 3.4). Tín hiệu nhóm cacbonyl xuất hiện tại C 177,3 (C=O); 2 cặp tín hiệu nhóm methin tại C 130,7 (2xCH) và 123,7 (2xCH) đặc trưng cho cấu trúc kaempferol. .
Bảng 3.4. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất C1 và hợp chất tham khảo
Vị trí Chất C1 Chất tham khảo [45] Ca,b Ha, c Mult (J= Hz) DEPT ≠C H a, c Mult (J= Hz) 2 148,1 - C 146,8 - 3 137,1 - C 135,6 - 4 177,3 - C 175,9 - 5 162,4 - C 160,7 - 6 99,3 6,23 CH 98,2 6,20 (s)
Vị trí Chất C1 Chất tham khảo [45] 7 165,5 - C 163,9 - 8 94,5 6,42 CH 93,5 6,40 (s) 9 158,2 - C 156,2 - 10 104,5 - C 103,1 - 1′ 123,7 - C 121,7 - 2′ 130,7 8,07 CH 129,5 8,08 (d, 8,5) 3′ 116,3 6,91 CH 115,4 6,92 (d, 8,5) 4′ 160,5 - C 159,2 - 5′ 116,3 6,91 CH 115,4 6,92 (d, 8,5) 6′ 130,7 8.07 CH 129,5 8,08 (d, 8,5)
aĐo trong methanol-d4; b125 MHz, c500 MHz; ≠C của kaempferol [45]
Từ những dữ kiện phổ trên, cùng sự so sánh với hợp chất kaempferol [45] nêu ra trong bảng 3.4, hợp chất C1 được xác định là kaempferol với
CTPT là C15H10O6, khối lượng M= 286,05 và CTCT như sau:
Công thức cấu tạo của hợp chất C1
Hợp chất C2 (β-sitosterol glucoside)
Cấu trúc của chất C2 được dự đoán là β-sitosterol glucoside, CTPT:
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), so sánh trên bản mỏng và phổ IR (hình 3.9) với chất β-sitosterol glucoside chuẩn.
Hình 3.9. Phổ IR của chất C2
Phổ IR (KBr) maxcm-1): 3430; 2939; 1644; 1463; 1370; 1029; 999; 830; 769; 663; 603; 433.
Phổ1H-NMR cho thấy tín hiệu của 6 nhóm methyl trong phần aglycone của phân từ CH3-18, CH3-19, CH3-21, CH3-26; CH3-27; CH3-29 ở δH 0,66;
1,01; 0,90; 0,88; 0,84; 0,82 ppm và δC 11,94; 19,87; 18,77; 19,25; 20,75 và 11,82 ppm. Tín hiệu đặc trưng của nối đơi thế ba lần (C-5; C-6) xuất hiện ở δH 5,33 ppm. Các proton tại δH 3,34 và 3,60 ppm tương ứng với các proton của nhóm hydroxymethylene 2H – 6’. Một tín hiệu multiplet của 1 proton ở δH
3,52 phù hợp với proton của nhóm methine H-3α. Các tín hiệu ở 5,33 và 4,22 được gán tương ứng với các proton của các nhóm methin H-6 và H-1’. Các proton của phần đường xuất hiện từ 2,91 đến 3,60 ppm.
Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của C2
Phổ 13C-NMR của C2 cho tín hiệu của 35 carbon. Tín hiệu đặc trưng của nối đôi thế 3 lần, chuyển dịch về phía trường thấp xuất hiện ở δC 140,62; 121,40 ppm (C5 và C6). Các tín hiệu khác cho thấy dấu hiệu đặc trưng cho đường glucose với nguyên tử C anome ở δC 100,9 ppm δH 4,22 ppm; tín hiệu ở δC 61,25 phù hợp với nguyên tử C của nhóm hydroxymethylene trong phần đường.
Phổ HSQC cho thấy rõ các tương tác trực tiếp C-H của C anome (C1’) với proton H-1’ và trong các nhóm methine của phân tử đường.
Các tương tác qua nhiều liên kết giữa C-3’ và các proton H-2’; H-4’; giữa C-4’ và các proton H-5’; H-6’cũng được thể hiện rõ trên phổ HMBC.
Cấu trúc của C2 được khẳng định thêm nhờ so sánh các số liệu phổ của chất C2với chất β-sitosterol glucoside được phân lập từ nhiều loài thực vật đã cơng bố, trong đó từ dịch chiết của lá cây Pseuderanthemum palatiferum
(Nees) Radlk [42] và Smiiax china L. [37].Trên phổ của chất C2 và chất so
sánh có 1 số tín hiệu có sự khác biệt với nhau, đặc biệt là tín hiệu của các nguyên tử carbon trong phần đường glucose, điều này có thể giải thích được do việc sử dụng dung môi đo phổ của 2 chất là khác nhau.
Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất C2 và chất so sánh Vị trí Chất C2(DMSO) Chất so sánh (CD3OD)[42] δC δH δC δH 1 36,37 37,27 2 31,53 29,90 3 76,90 3,15 78,99 3,78 4 42,01 38,54 5 140,62 140,30 6 121,40 5,33 121,94 5,36 7 31,59 31,81 8 33,49 31,81 9 49,77 50,13 10 36,37 36,60 11 20,88 20,94 12 38,45 39,68 13 42,01 42,22 14 56,34 56,68 15 24,02 24,14
Vị trí Chất C2(DMSO) Chất so sánh (CD3OD)[42] 16 29,40 28,11 17 55,58 55,97 18 11,94 0,66 11,62 0,65 19 19,87 1,01 19,07 0,97 20 35,62 36,03 21 18,77 0,90 18,54 1,08 22 36,98 33,83 23 25,58 25,95 24 45,30 45,79 25 28,88 29,04 26 19,25 0,88 18,73 0,75 27 20,75 0,84 19,50 0,88 28 22,77 22,94 29 11,82 0,82 11,67 0,79 1’ 100,90 4,22 101,05 4,38 2’ 73,62 2,91 73,50 3,32 3’ 77,17 3,45 76,45 3,54 4’ 70,27 3,00 70,09 3,32 5’ 76,87 3,15 75,89 3,38 6’ 61,25 3,34/3,60 61,61 3,18/3,18
Từ việc phân tích các dữ liệu phổ của chất C2 và so sánh với tài liệu
tham khảo [42], cho phép khẳng định cấu trúc của chất C2 là β-sitosterol glucoside (daucosterol).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
-Đã định tính sơ bộ các lớp chất thường gặp trong thực vật bằng phản ứng hóa học và cho kết quả: mẫu hoa đu đủ đực dùng nghiên cứu có các lớp chất đó là: alkaloid, flavonoid, saponin steroid, đường khử, polyphenol, sterol, coumarin, polysaccarid, carotene, chất béo.
- Từ nguyên liệu ban đầu, bằng các phương pháp khác nhau đã thu được các loại dịch chiết chloroform. Đã thử hoạt độc tế bào của các dịch chiết chloroform này trên các dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư gan (Hep 3B), ung thư vú (MCF-7), kết quả cho thấy các phân đoạn dịch chiết chloroform đều thể hiện hoạt tính tốt, cụ thể phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng ethanol có tác dụng mạnh nhất trên tế bào ung thư gan (Hep 3B); phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng nước có tác dụng mạnh trên cả 2 dòng tế bào ung thư phổi (A549) và vú (MCF-7); phân đoạn cao chiết chloroform từ cao tổng methanol (mẫu M/C) có tác dụng đối với cả 3 dịng tế bào ung thư (A549), gan (Hep 3B) và vú (MCF-7).
- Đã định danh sơ bộ thành phần hóa học trong cao chloroform bằng phương pháp phổ GC/MS có 9/9 cấu tử được định danh với hàm lượng lớn bao gồm: 2H-Quinolizine-1-metanol, octahydro(23,74%), 2(3H)- Furanonedihydro-3-hydroxy-4,4-dimetyl(24,22%);3,3,5,5
tetrametylcyclohexanol(15,88%); Ethylbenzene(9,56%); Glycyl-L-proline (8,31%); 4(1H)-pyrimidinone,6-amino-2-metyl-5-nitroso (7,51%); Benzene, 1,3,dimethyl (5,29% ), D-Limonene (2,78%); 2-Pentanone, 4-hydroxy- 4methyl (2,7%).
- Từ cao chiết chloroform, bằng các phương pháp sắc ký cột silicagel, kết hợp với sắc ký lớp mỏng và các phương pháp phổ hiện đại như NMR,
DEPT, HMBC, HSQC, đã phân lập và xác định cấu trúc của hai chất sạch baogồm: C1 Kaempferol và C2: β-sitosterol glucoside.
2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục phâp lập thêm và xác định cấu trúc của chất sạch phân lập được từ các phân đoạn còn lại của dịch chiết chloroform của hoa đu đủ đực.
- Thăm dị các hoạt tính sinh học khác của 2 chất đã phân lập được cũng như dịch chiết và các hợp chất phân lập được khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827.
[2]. Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb Y học, Hà Nội.
[3]. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc,
Nxb Y học, Hà Nội.
[4]. Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012) “Hai cycloratane triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ (carica papaya L.)“, Tạp chí hóa họctập 50 (4A), pp 166-169.
[5]. Hồ Thị Hà (2014), Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá Đu đủ(Carica papaya Linn), Luận án tiến sĩ. Đại học
Bách khoa Hà nội.
[6]. Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên (2015),“Khảo sát thành phần hoá học của một số dịch chiết từ hoa Đuđủ đực thu hái tại Đà Nẵng“,Tạp
chí Khoa học Cơng nghệ ĐHĐN; Số 03(88) ; Trang 119.
[7]. Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,Trang 360-362.
[8]. Phạm Kim Mãn và cộng sự (2001),“Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng trong điều trị ung thư“, Tạp chí dược liệu, 6(2+3), pp 58-62. [9]. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) ‘‘Điều
tra hợp chất carotenoid trong một số thực vật của Việt Nam“, Tạp chí
khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên và công nghệ, (23), pp 130-
[10] Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái, (2013) "Tách chiết chymopapain từ nhựa quả Đu đủ xanh (Carica papaya) và chế thử thành dạng bột để pha tiêm", Tạp chí HóaHọc 50(6): 767-771.
[11]. Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004),Cây Đu đủ và kỹ thuật trồng, Nxb lao động xã hội.
[12]. Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác định khả năng phòng chống ung thư và bản chất hóa học của một số cây thuốc Việt Nam, Luận án tiến
sĩ sinh học.
[13]. Nguyễn Tường Vân, Đặng Hồng Vân, Phạm Gia Khơi, Trần Mạnh Bình, Phan Quốc Kinh (1983) “Chiết xuất và xác định carpaine alkaloid của lá Đu đủ‘‘,Tạp chí dược học số 4.
[14]. Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý củathuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.
[15]. Đỗ Quốc Việt, Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây bầu đất (Gynura sarmentosa DC.), cây cải đồng (Grangea maderaspatana poir.) và quả chuối hột (Musa balbisiana colla), Luận
án tiến sĩ (2006).
Tiếng Anh
[16]. Aravind G., Debjit Bhowmik, Duraivel. S., Harish G. (2013) ‘’Traditional and medicinal uses of carica papaya”, Journal of medicinal plants studies, vol 1, Issue 1,pp 7-15.
[17]. Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd. Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002) “Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines”,Journal of Medical Sciences, vol 2.Isuae 2.page 55-58.
[18]. Abrham W.B., (1978), “Techniques of Animal and Clinical toxicology”,
Med. Pub. Chicago, p 55 – 68.
[19]. Antonella Canini, Daniela Alesiani, Giuseppe D’Arcangelo, Pietro Tagliatesta (2007) “Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L. leaf”,Journal of food
composition and analysis, vol 20, pp 584-590.
[20]. Beverly A. Teicher, (1997), Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval, Humana Press,
Totowa, New Jersey.
[21]. Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) “Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave”, Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 – 173.
[22]. Chung-Shih Tang (1979) “New macrocyclic Δ1–piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II”,Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652.
[23]. David S., Seigler, Guido F., Pauli, Adolf Nahrstedt, Rosemary Leen (2002) “Cyanogenic allosides and glucosides from passiflora edulis and carica papaya”, Phytochemistry, vol 60, pp 873-882.
[24]. Eno AE, Owo OI, Itam EH, Konya RS, (2000), “Blood pressure depression by the fruit juice of Carica papaya (L.) in renal and DOCA-induced hypertension in the rat”, Phytother Res,
Jun;14(4):235-9.
[25]. Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), “Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain”, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66- 70.
[26]. Giordani R., Cardenas M.L., Moulin-Traffort J., Regli P., (1996), “Fungicidal activity of latex sap from Carica papaya and antifungal effect of D(+)-glucosamine on Candida albicans growth”, Mycoses,
39, 103-110.
[27]. Govindachari T.R., Naga rajan K. and Viswanathan N. (1965)