Phát hiện base Xác định một phát hiện base cho mỗi cụm.
Chấm điểm chất lượng Ấn định điểm chất lượng cho mỗi phát hiện base. Tạo mẫu
Bước đầu tiên trong quy trình công việc của RTA là tạo mẫu, tức là xác định vị trí của mỗi cụm trong ô bằng cách sử dụng các tọa độ X và Y.
Việc tạo mẫu yêu cầu dữ liệu hình ảnh từ 5 chu kỳ đầu tiên trong lần chạy. Sau khi chụp ảnh xong chu kỳ mẫu cuối cùng của ô, mẫu sẽ được tạo.
LƯU Ý Để phát hiện cụm trong khi tạo mẫu, phải có ít nhất 1 base không thuộc loại G trong 5 chu kỳ đầu tiên. Với mọi trình tự chỉ thị, RTA2 yêu cầu ít nhất 1 không thuộc loại G trong 2 chu kỳ đầu tiên.
Mẫu được dùng làm tham chiếu cho bước đăng ký và trích xuất cường độ tiếp theo. Các vị trí cụm của toàn bộ tế bào dòng chảy được ghi vào các tệp vị trí cụm (*.locs), mỗi làn 1 tệp.
Đăng ký và trích xuất cường độ
Quy trình đăng ký và trích xuất cường độ bắt đầu sau khi tạo mẫu.
u Quy trình đăng ký sẽ căn chỉnh hình ảnh được tạo trong mọi chu kỳ chụp ảnh tiếp theo dựa trên mẫu.
u Quy trình trích xuất cường độ xác định giá trị cường độ cho từng cụm trong mẫu của một hình ảnh cụ thể.
Nếu bất kỳ hình ảnh nào trong một chu kỳ không được đăng ký thành công thì không có phát hiện base nào được tạo cho ô đó trong chu kỳ đó.
Hiệu chỉnh định pha
Trong phản ứng giải trình tự, mỗi sợi ADN trong một cụm kéo dài thêm 1 base trong mỗi chu kỳ. Định pha và tiền định pha xảy ra khi một sợi trở nên không hợp pha với chu kỳ kết hợp hiện tại.
u Định pha xảy ra khi một base rơi lại phía sau.
Hình 29 Định pha và tiền định pha
A Đoạn đọc có base định pha B Đoạn đọc có base tiền định pha.
RTA2 hiệu chỉnh các ảnh hưởng của định pha và tiền định pha, nhờ vậy tối đa hóa chất lượng dữ liệu ở mỗi chu kỳ trong suốt lần chạy.