gia.. .21 CHƯƠN G2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGH IN CỨU
2 3 Phương pháp xác định các đặc tính ỹ thuật
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu
Thúc đẩy nhanh 25 oC± 2 oC 37 oC ± 2 oC 45 oC ± 2 oC Nhiệt độ 5oC ± 3 oC Nghiên cứu tính ổn định
Nhiệt độ bảo quản (-40oC± 2oC)
Thực hiện 6 lần với MCQT Xác định ĐVMD
Đặc tính kháng ngun Hóa học Xác định đặc tính kỹ thuật của lơ
RaP01 Đặc tính cảm quan, vật lý Vơ trùng, an tồn, nhận dạng S ản p hẩ m n gh iê n c ứ u L ô R aP 01
2.3.2. Phương pháp xác định các đặc tính kỹ thuật
2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra vô trùng
Môi trường dùng cho thử nghiệm:
- Môi trường Thioglycolate: Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và nấm. - Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth): Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và ị hí
Mỗi lo t môi trường phải kiểm tra chất lượng về tính vơ trùng tính t ng sinh trước khi sử dụng.
Cách tiến hành:
- Hoàn nguyên 10 ống mẫu chuẩn ho gà đông hô trong nước cất pha tiêm vô huẩn.
- Cấy hỗn dịch mẫu thử đã hoàn nguyên ho gà của mỗi ống vào 1 ống môi trường Thioglycolate và 1 ống môi trường TSB Lượng mẫu cấy vào môi trường là 0 5%
- Sau khi cấy mẫu thử xong ủ các ống môi trường Thioglycolate ở nhiệt độ 30°C – 35°C và các ống môi trường TSB ở nhiệt độ 20°C – 25°C trong 14 ngày
Đọc kết quả:
- Hàng ngày theo dõi và ghi chép Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14. - Mẫu chuẩn được coi là vô trùng hi hông c ống môi trường nào bị nhiễm (c vi sinh vật phát triển).
2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra nhận dạng kháng nguyên PT, FHA
VXMC ho gà vô bào đông hô được hồi chỉnh với nước cất sau đ giải hấp phụ Al(OH)3 bằng Natri Citrate. Nhận d ng háng nguyên PT FH dựa trên sự kết hợp đặc hiệu với háng thể tương ứng trong gel th ch theo nguyên lý của phản ứng miễn dịch khuếch tán vòng ép (Ouchterlony) Kháng nguyên PT FH từ các giếng được khuếch tán ra xung quanh sẽ phản ứng với háng thể đặc hiệu t o thành đường kết tủa trên gel th ch:
- T i chứng dương: Xuất hiện đường tủa của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH chuẩn.
- T i chứng m (PBS): Không xuất hiện đường tủa.
Vắc xin được coi là đ t tiêu chuẩn khi t i vị trí iểm tra dung dịch xuất hiện đường tủa màu xanh của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH c trong vắc xin.
2.3.2.3. Phương pháp kiểm tra an toàn chung
Phương pháp: Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt và chuột lang. Mỗi chuột nhắt được tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 1 liều đơn cho người và mỗi chuột lang được tiêm ổ bụng với liều tiêm hơng q 5 liều đơn cho người. Thể tích tiêm hông quá 1 ml cho một chuột nhắt và hông quá 5 ml cho một chuột lang. Chuột phải được quan sát ỹ 2 giờ đầu sau hi tiêm và trong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm C n trọng lượng chuột vào ngày thứ 3 và thứ 7 sau hi tiêm
Tiêu chuẩn: Tồn bộ chuột thí nghiệm sống s t hỏe m nh lên c n trong suốt thời gian thí nghiệm.
2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý
Ở d ng đơng hơ:
+ Tiêu chí đánh giá: Quan sát bằng mắt thường hình d ng màu sắc và độ đồng d ng của sản phẩm.
+ Tiêu chuẩn chấp nhận: D ng bánh hông bong teo sau hoàn nguyên t o hỗn dịch đồng nhất màu trắng đục.
- Kiểm tra chân không: phát ánh sáng xanh hi iểm tra trên máy Tesla Coil (Nhật). Yêu cầu: ống vắc xin ho gà vô bào đông hô phải đ t được độ ín
- Kiểm tra độ ẩm tồn dư:
Số lượng mẫu: 6 ống.
Nguyên tắc: Xác định lượng nước c trong sản phẩm bằng cách làm bay hơi nước ở nhiệt độ nhất định C n sản phẩm trước và sau hi sấy, từ đ tính ra phần tr m nước c trong sản phẩm.
Tiến hành:
- Bật máy hút ẩm trước khi tiến hành 1 giờ.
- Sấy cốc thủy tinh ở 105°C đến trọng lượng hông đổi.
- Lấy cốc cho vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ thường. - Sau đ tiến hành c n cốc: m1.
- C n cốc chứa mẫu: m2.
- Sấy cốc mẫu ở nhiệt độ 105°C đến trọng lượng hô hông đổi (khoảng 4 giờ).
- Lấy cốc đặt nhanh vào bình hút ẩm Để nguội đến nhiệt độ phịng - C n cốc mẫu sau khi sấy: m3.
- Tính tốn:
Độ ẩm (%)
Trong đ : m1: Trọng lượng cốc
x 100
m2: Trọng lượng cốc và mẫu trước khi sấy m3: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi sấy Yêu cầu: ≤ 3%.
- Kiểm tra độ đồng đều khối lượng:
Số lượng mẫu: 20 ống.
Phương pháp: C n xác định trọng lượng hô của sản phẩm trong mỗi ống. Mỗi sản phẩm c n ít nhất 20 ống Xác định SD và CV%.
Yêu cầu: CV ≤ 7 5%.
Ở d ng sau hoàn nguyên:
- Kiểm tra tốc độ tạo hỗn dịch đồng nhất sau hoàn nguyên:
Phương pháp kiểm tra: Hồn ngun mẫu chuẩn đơng hơ trong nước cất pha tiêm quan sát và ghi nhận thời gian mẫu thử đơng hơ t o thành hỗn dịch đồng nhất sau hồn nguyên
Yêu cầu: Thời gian t o hỗn dịch đồng nhất ≤ 60 gi y
- Kiểm tra pH:
Số lượng mẫu: 10 - 20 ml.
Phương pháp kiểm tra: Phương pháp đo điện thế - điện cực bằng máy đo pH.
pH là một số biểu thị quy ước nồng độ ion hydrogen của dung dịch nước là logarit của nghịch đảo ho t độ ion hydro tính bằng ion gam/lit Đối với dung dịch loãng ho t độ xấp xỉ bằng nồng độ ta c :
pH = _ lg CH+
Trị số pH cho ta biết tính chất axit hay iềm của một dung dịch pH = 7 biểu thị môi trường trung tính pH> 7 biểu thị mơi trường iềm pH< 7 biểu thị môi trường axit
pH của một dung dịch được xác định bằng cách đo thế hiệu giữa điện cực chỉ thị nh y cảm với ion hydrogen (điện cực thủy tinh) và một điện cực so sánh (điện cực calomen bão hòa)
Yêu cầu: pH = 6 - 7.
2.3.2.5. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu hóa học - Kiểm tra hàm lượng tá chất Al(OH)3:
Phương pháp: Chuẩn độ Complexon.
Nguyên tắc: Gel nhơm trong mẫu vắc xin hấp phụ được hịa tan bằng cách đun n ng với axit đậm đặc. Ion Al3+ sẽ t o phức với muối Natri Ethylendiamintetraacetate (Na2-EDT ) dư sau đ lượng EDT còn l i được chuẩn độ ngược với dung dịch sunfat đồng CuSO4. Khoảng tuyến tính 0 4 – 11 mg Al.
Cách tiến hành: Hồn ngun mẫu chuẩn đơng hơ, sau đ lấy 3 ml mẫu thử + 8 giọt HNO3 đậm đặc + 1 ml H2SO4 đậm đặc Đun ống nghiệm trên bếp điện cách cát trong tủ hút hí độc, thấy h i trắng dày đặc thoát ra Tiếp tục đun n ng (c thể cho thêm vài giọt HNO3) cho đến khi dung dịch trong ống nghiệm trong suốt hông màu Để nguội và thêm 10 ml nước cất. Dùng chỉ thị màu methyl da cam để thêm NaOH 50% vào mỗi ống nghiệm cho đến hi c màu đỏ cam. Nếu dung dịch đục thì thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Chuyển dung dịch trong ống nghiệm sang bình tam giác tráng s ch ống nghiệm 3 lần bằng 25 ml nước cất Thêm vào mỗi bình 25 ml dung dịch EDTA 0,01 M, 10 ml dung dịch đệm acetat pH 4 4; đun sôi nhẹ trong 3 phút và thêm 1 ml chỉ thị màu pyridinazonaphtol Chuẩn độ n ng bằng dung dịch CuSO4 0 01 M cho đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng hồng sang n u tía Bắt đầu với mẫu trắng các mẫu còn l i được chuẩn độ tới điểm cuối cùng màu với mẫu trắng.
Tính ết quả:
Al3+ (mg/ml) ( ) Al(OH)3 (mg/ml) = Al3+(mg/ml) x 2,89 Trong đ :
N: Lượng dung dịch CuSO4 0 01 M dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) n: Lượng dung dịch CuSO4 0 01 M dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) 0 2698: Lượng Al3+ tương đương với 1 ml CuSO4 0,01 M (mg) 2 89: Lượng Al(OH)3 tương đương với 1 mg Al3+ (mg)
Tiêu chuẩn chấp nhận: Hàm lượng tá chất nhôm trong hoảng ≤ 2.5 mg/ml.
- Hàm lượng Merthiolate:
Hàm lượng chất bảo quản Merthiolate được xác định bằng cách đo quang ở bước s ng 470 nm với sự tham gia của Diphenilthiocacbazon (dithizon) và chiết trong Chloroform. Cách tiến hành như sau:
+ Rửa các phễu chiết và bình tam giác nút mài bằng axit nitric đậm đặc, tráng rửa s ch bằng nước cất.
+ Đường chuẩn: Cho vào mỗi bình theo thứ tự: 0; 0,4; 0,8; 1 2 và 1 6 ml dung dịch chuẩn Merthiolate 0,01%.
+ Cho dung dịch mẫu thử vào hai bình hác mỗi bình 1 ml.
+ Thêm vào mỗi bình theo thứ tự 10 ml dung dịch amonium acetate 1% pH = 6, 10 ml dung dịch dithizone 0,01% mới pha trong Chloroform. Lắc trong 45 gi y
+ Tách cẩn thận lớp Chloroform qua phễu chiết và cho vào cống đo + Đo quang ở bước s ng = 470 nm.
+ Hàm lượng Merthiolate trong mẫu tính bằng % theo cơng thức:
Trong đ :
X(%) ax100
a
1x1000 10
a: số mg Merthiolate của mẫu thử tính theo đường chuẩn 100: Tính ra %
1000: đổi mg ra g
1: Lượng mẫu đem ph n tích Tiêu chuẩn: ≤ 0,02%.
- Hàm lượng muối Natri clorid:
Hàm lượng muối Natri clorid được xác định bằng phương pháp Mohr: Dựa trên phản ứng xác định ion Cl- bằng dung dịch b c nitrat (AgNO3) 0,1 N với chỉ thị màu Kali cromat K2CrO4 10%. Từ lượng AgNO3 tiêu thụ suy ra hàm lượng NaCl.
Ag+ + Cl- AgCl (trắng) 2Ag+ + CrO42- Ag2CrO4 (đỏ g ch) + Lắc đều mẫu thử.
+ Hút chính xác 1 ml mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml + Thêm 3 ml nước cất và 3 giọt K2CrO4 10%, lắc đều.
+ Chuẩn độ bằng dung dịch AgNO3 0 1 N cho đến khi xuất hiện kết tủa màu đỏ g ch. Ghi số N ml AgNO3 đã dùng
+ Tính tốn theo cơng thức:
mgNaCl / l N * 5,85*100 (%)
1*1000
Trong đ :
1 ml dung dịch AgNO3 0 1 N tương ứng với 5,85 mg NaCl N: số ml AgNO3 0 1 N dùng để chuẩn độ mẫu thử
100: tính theo % 1000: đổi mg ra g
Tiêu chuẩn: 0 7 – 1,0%.
- Hàm lượng Formaldehyde:
Định lượng Formaldehyde bằng cách đo cường độ màu của 3,5- diacetyl-1,4-dihydrolutidin ở bước s ng 412 nm Phức hợp này c màu vàng chanh được t o thành do phản ứng của Formaldehyde tự do trong mẫu kiểm tra với Acetylaceton và amoni trong môi trường acid yếu ở nhiệt độ cao để t ng tốc độ phản ứng. Cách tiến hành như sau:
+ Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm.
+ X y dựng đường chuẩn: Cho lần lượt vào các ống nghiệm chính xác 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 ml dung dịch chuẩn Formaldehyde 2 g/ml Hàm lượng Formaldehyde tương ứng trong mỗi ống nghiệm là 0; 0 8; 1 6; 2 4; 3 2; 4,0 g.
+ Thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm vừa đủ 2 ml.
+ Thêm vào mỗi ống nghiệm 2 ml dung dịch đệm acetate (pH= 6).
+ Đặt mẫu và chuẩn vào bếp cách thủy ở 60oC trong 10 phút Dung dịch c màu vàng chanh
+ Lấy ra làm nguội với nước l nh từ 2 – 3 phút Đo quang ở bước s ng 412 nm trong vòng 30 phút
Tiêu chuẩn: Hàm lượng Formaldehyde ≤ 0,01%.
2.3.2.6. Kiểm tra các đặc tính kháng nguyên - Xác định hàm lượng protein toàn phần:
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp của Lowry. Dung dịch chuẩn được sử dụng là Albumin huyết thanh bò (BS – Bovine serum albumin).
Tiến hành: 5 mg mẫu hòa tan với 1 ml nước cất. Lấy 100 µl dung dịch mẫu hòa với 2,9 ml nước cất trong ống nghiệm pyrex. Thêm 1 0 ml dung dịch A (Lowry reagent – code: L3540 – Sigma) vào ống nghiệm lắc đều để yên trong 20 phút Sau đ thêm 0 5 ml thuốc thử Folin 0,4 N, lắc đều và để yên trong 30 phút Sau 30 phút tiến hành đo mật độ quang ở bước s ng 𝜆 = 750 nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu lặp và lấy giá trị trung bình Sử dụng chất chuẩn BSA (0,5 mg/ml) để tiến hành x y dựng đường chuẩn.
- Xác định độ hấp phụ của kháng nguyên PT và FHA trong tá chất nhôm:
Chuẩn bị mẫu:
+ Hồn ngun 10 ống vắc xin đơng hô trong 10 ml nước cất vô trùng Ly t m lấy nước nổi (phần mẫu để xác định lượng háng ngun hơng hấp phụ).
+ Hồn ngun 10 ống vắc xin đông hô hác trong 10 ml dung dịch Natri Citrate để đ t nồng độ Natri Citrate cuối cùng 0 5% Ủ 48 giờ/37oC để giải hấp phụ háng nguyên ra hỏi gel Al(OH)3 (phần mẫu để xác định háng nguyên toàn phần).
Xác định hàm lượng háng nguyên: Thực hiện phản ứng ELISA để xác định hàm lượng háng nguyên PT hoặc FHA trong mẫu thử đã chuẩn bị ở trên Tính độ hấp phụ: Độ hấp phụ là tỷ lệ giữa lượng háng nguyên đã hấp phụ trên l(OH)3 so với lượng háng nguyên tổng số c trong vắc xin ban đầu theo công thức:
Độ hấp phụ
- Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà:
Chuẩn bị chuột:
+ Chuột nhắt trắng 3-4 tuần tuổi, sau khi chọn lựa chuột được ph n vào các lồng chia riêng chuột đực cái vào các lồng hác nhau
+ Chuột được ph n ngẫu nhiên vào các lồng. Mỗi lồng 12-13 con cùng giới, mỗi độ pha gồm 2 lồng (đối với nh m chuột tiêm miễn dịch). Chuột được đánh dấu nhằm ph n biệt giữa các độ pha và giữa các lơ thử nghiệm.
Pha lỗng VXMC, VXMT: - Pha vắc xin chuẩn:
+ Sát trùng ống VXMC bằng bông cồn 70°
+ Dùng cưa sắt nhỏ cưa quanh cổ và 1/3 trên của đầu ống rồi bẻ ống theo 2 thì (1/3 trên đến cổ ống).
+ Hoàn nguyên vắc xin mẫu chuẩn bằng nước muối sinh lý vơ trùng theo tỷ lệ thích hợp với từng lo i vắc xin để được dung dịch gốc (độ pha A). Tiếp tục pha loãng bậc 5 thành các độ pha sao cho sau khi thử thách ED50 nằm giữa 3 độ pha loãng
- Pha vắc xin thử:
+ Sát trùng ống VXMT bằng bông cồn 70°
+ Dùng cưa sắt nhỏ cưa quanh cổ và 1/3 trên của đầu ống rồi bẻ ống theo 2 thì (1/3 trên đến cổ ống).
+ Hoàn nguyên VXMT bằng nước muối sinh lý + Pha loãng bậc 5 thành các độ pha.
Tiêm miễn dịch cho chuột:
- Tiến hành tiêm trên các nh m chuột sau hi chúng đã được n uống đầy đủ 1 giờ.
- Tiêm miễn dịch cho chuột theo thứ tự từ loãng đến đặc (từ độ pha C đến A) cho cả lô VXMT và mẫu chuẩn.
- Liều/đường tiêm: 0 5 ml/con/ổ bụng.
Ch m s c chuột thí nghiệm: Chuột được n uống đầy đủ và vệ sinh lồng chuồng trong 21 ngày sau hi tiêm miễn dịch. Trong thời gian miễn dịch (21 ngày) chuột phải khoẻ và t ng trọng bình thường.
Pha tiêm thử thách:
- Liều LD50 được dò trước hi tiêm thử thách
- Sau hi tiêm miễn dịch 21 ngày chuột được tiêm thử thách với chủng ho gà 18323
- Pha chủng thử thách: Chủng ho gà 18323 chứa 10.109/ml (A0) được pha loãng như sau:
A 1 10.109/2 ml = 1 ml A0 1 ml đệm Casein 1% A 2 109/2 ml = 1 ml A1 9 ml đệm Casein 1% A 3 106/0,02 ml = 1 ml A2 9 ml đệm Casein 1% A 4 105/0,02 ml = 1 ml A3 9 ml đệm Casein 1% A 5 50000/0 ,02 ml = 6 ml A4 6 ml đệm Casein 1% A 6 5000/0, 02 ml = 1 ml A5 9 ml đệm Casein 1% A 7 500/0,0 2 ml = 1 ml A6 9 ml đệm Casein 1% A 8 100/0,0 2 ml = 1 ml A7 4 ml đệm Casein 1% A 9 ml20/0,02 =ml A81 Casein 1%4 ml đệm
Tiêm thử thách:
- Tiêm não 10 chuột (nh m chứng m) mỗi con 0,02 ml dung dịch Casein 1% để c những thông tin về sự phá huỷ não hông đặc hiệu: Dùng bơm im tiêm Hamitol tiêm vào não chuột ở 3 nh m chứng, mỗi nh m 10 con (được nuôi song song cùng với chuột đã tiêm miễn dịch), mỗi con tiêm 0,02 ml các độ pha theo thứ tự: A9 - A8 - 7 để kiểm tra độc lực của chủng thử