3.2.1. Đặc tính cảm quan
Tổng điểm cảm quan của các viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau bị ảnh hưởng vào đặc tính cấu trúc của carbohydrate sử dụng. Carbohydate mạch thẳng, dài, nhiều nhóm methoxyl tạo kết cấu viên hoàn kém hơn so với carbohydrate mạch ngắn. Tuy nhiên, carbohydrate mạch ngắn và carbohydrate mạch thẳng có nhiều nhóm methoxyl không tạo ra viên hoàn có kết cấu tốt bằng carbohydrate mạch dài và nhiều nhóm hydroxyl.
Loại carbohydrate và hàm lượng carbohydrate sử dụng trong sản xuất viên hoàn ảnh hưởng lên tổng điểm cảm quan của viên hoàn (p<0.05). Tổng điểm cảm quan của viên hoàn tỷ lệ thuận với hàm lượng tá dược carbohydrate. Tổng điểm cảm quan tăng khi hàm lượng carbohydrate tăng và dao động trong khoảng 14,5 cho đến 19,5 điểm. Viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose, dextrin và đường mía có tổng điểm cảm quan khác nhau và tăng dần tương ứng 15,50, 16,7 và 17,9 điểm. Tổng điểm cảm quan của viên hoàn được phân làm
3 nhóm tương ứng với khoảng điểm cảm quan 16-17 điểm (nhóm 1 (carboxymethyl cellulose)), 17-18 điểm nhóm 2 (dextrin) và 18-20 điểm (nhóm 3 (đường mía)) (Hình 3.1 đến 3.4). Trong quá trình sản xuất viên hoàn, đường mía được đánh giá cao hơn so với dextrin và carboxymethyl cellulose, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu và sản xuất trong đông y về viên hoàn, như viên hoàn nghệ, viên hoàn tam thất.
Hình 3.1. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ dextrin khác nhau
Hình 3.2. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ carboxymethyl cellulose khác nhau
Hình 3.3. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ đường mía khác nhau
Hình 3.4. Điểm cảm quan bình quân của viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau
3.2.2. Đặc tính trương nở
Loại carbohydrate và hàm lượng carbohydrate tác động lên độ trương nở của viên hoàn (p<0,05), điều này được thể hiện khi phân tích ANOVA. Sự khác biệt này có thể phụ thuộc rất lớn vào cấu trúc của carbohydrate, cụ thể: đường mía (C12H22O11) được cấu tạo bởi glucose và fructose với sự kết thúc chuỗi bằng "oside" và còn được biết đến với tên gọi α-D-glucopyranozyl- (1→2)-β- D-fructofuranoside. Carboxymethyl cellulose là dẫn xuất của cellulose có các nhóm carboxymethyl (-CH2COOH) liên kết với một số nhóm hydroxyl của glucopyranose monomer. Dextrin là carbohydrate trọng lượng phân tử thấp - sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột hoặc glycogen với các đơn vị D- glucose và liên kết glycosidic α-(1 → 4) hoặc α-(1 → 6) [77,78,79]. Kết quả thực nghiệm chỉ rõ điều này, viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch dài sẽ có độ trương nở tốt hơn so với viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch ngắn.
Độ trương nở của viên hoàn thay đổi khi sử dụng các loại carbohydrate khác nhau, kết quả cho thấy độ trương nở của viên hoàn dao dộng từ 127,67 ±7,51 tới 290,00 ±8,16 %, khi so sánh với kích thước ban đầu của viên hoàn sử dụng cùng loại carbohydrate. Độ trương nở của viên hoàn tỷ lệ thuận với hàm lượng carbohydrate sử dụng. Viên hoàn có độ trương nở là 176,67 ±5,77, 290,00 ±8,16 và 180,00 ±10,00 % so với ban đầu, tương ứng với viên hoàn chứa dextrin, carboxymethyl cellulose và đường mía. Độ trương nở của viên hoàn được sắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau: dextrin, đường mía và carboxymethyl cellulose (Hình 3.5 đến 3.8). Viên hoàn có độ trương nở bình quân là 154, 186 và 232 % so với viên hoàn ban đầu, tương ứng với dextrin, đường mía và carboxymethyl cellulose.
Như vậy, độ trương nở viên hoàn sử dụng dextrin ở hàm lượng 20 % là thấp nhất và độ trương nở cao nhất là viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose ở hàm lượng 40 %.
Hình 3.5. Độ trương nở của viên hoàn chứa dextrin nồng độ khác nhau
Hình 3.6. Độ trương nở của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose nồng độ khác nhau
Hình 3.7. Độ trương nở của viên hoàn chứa đường mía nồng độ khác nhau
Hình 3.8. Độ trương nở bình quân của viên hoàn chứa carbohydrate khác nhau
3.2.3. Đặc tính bán rã
Trong nghiên cứu, khi phân tích cấu trúc carbohydrate sử dụng làm tá dược sản xuất viên hoàn, khả năng nhũ hóa và ổn định cấu trúc của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose cao hơn so với viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch ngắn. Thời gian hàm lượng hoạt chất viên hoàn giảm một nửa so với ban đầu được xác định là thời gian bán rã (Khả năng bán rã) của viên hoàn, phân tích thông số này sẽ hữu ích cho quá trình kiểm soát sự hấp thụ và chuyển hóa khác nhau trong cơ thể [80]. Viên hoàn trong nghiên cứu này xảy ra quá trình đa phân rã vì chứa nhiều hoạt chất sinh học khác nhau.
Loại carbohydrate sử dụng làm tá dược ảnh hưởng lên khả năng bán rã của viên hoàn (p<0,05) và điều này cũng được tìm thấy ở hàm lượng carbohydrate sử dụng trong viên hoàn (p<0,05). Viên hoàn nhận khả năng bán rã cao nhất và thấp nhất tương ứng 14,67 ±1,53 và 206,00 ±5,29 khi sử dụng dextrin 20 % và carboxymethyl cellulose 40 %. Khả năng bán rã bình quân của viên hoàn được sắp xếp theo thứ tự giảm dần dextrin, đường mía, carboxymethyl cellulose, tương ứng thời gian 20,07, 28,47 và 163,73 phút. Hàm lượng carbohydrate sử dụng trong viên hoàn tỷ lệ nghịch với khả năng bán rã theo mô hình tuyến tính. Khoảng khả năng bán rã (thời gian bán rã tính theo phút) của viên hoàn là 14,67-27,00, 125,67-206,00 và 17,67-38,67 phút, tương ứng khi viên hoàn chứa dextrin, carboxymethyl cellulose và đường mía (Hình 3.9 đến 3.12). Khả năng tạo kết cấu của viên hoàn khi sử dụng các carbohydrate khác nhau liên quan mật thiết đến khả năng bán rã của chúng, điều này được minh chứng cụ thể thông qua sự bán rã của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose thấp nhất (125,67 ±3,21 phút), dextrin (27,00 ±1,00 phút) và đường mía (38,67 ±1,53 phút).
Hình 3.9. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa dextrin nồng độ khác nhau
Hình 3.10. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose nồng độ khác nhau
Hình 3.11. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa đường mía nồng độ khác nhau
Hình 3.12. Khả năng bán rã bình quân của viên hoàn chứa carbohydrate nồng độ khác nhau
3.2.4. Mật độ khối lượng của viên hoàn
Mối tương quan chặt chẽ giữa mật độ khối lượng viên hoàn với số lượng và khối lượng viên hoàn được xác định là trên 10 cm3. Độ nén, độ chắc, độ rỗng của viên hoàn và độ đồng đều về kích thước của viên hoàn ảnh hưởng lên số lượng và khối lượng viên hoàn trên 10 cm3. Độ rỗng khối viên hoàn càng lớn, độ đồng đều về kích thước và hình dáng viên hoàn không cao, số lượng viên hoàn trong 10 cm3 càng giảm. Mật độ khối lượng viên hoàn nhỏ khi độ nén và độ chắc của viên hoàn thấp. Thể tích chiếm chỗ của viên hoàn trong hộp/lọ thuốc được tính toán dựa trên mật độ khối lượng viên hoàn, điều này cũng góp phần lớn vào tính toán thể tích hộp/lọ đựng viên hoàn [81,82].
Hàm lượng và loại carbohydrate bổ sung trong viên hoàn tác động lên mật độ khối lượng viên hoàn (p<0,05) và dao động trong khoảng 0,54 ±0,01 tới 0,68 ±0,01 g/cm3. Sự gia tăng hàm lượng carbohydrate tỷ lệ thuận với mật độ khối lượng viên hoàn và mật độ viên hoàn biến đổi theo mô hình tuyến tính. Viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau có khoảng mật độ khối lượng biến đổi theo thứ tự giảm dần 0,61 ±0,00 - 0,68 ±0,01 (carboxymethyl cellulose),
0,57 ±0,01 - 0,64 ±0,01 g/cm3 (dextrin) và 0,54 ±0,01 - 0,63 ±0,01 (đường mía), khi giảm hàm lượng carbohydrate từ 40 đến 20 % (Hình 3.13 đến 3.16). Hàm lượng carbohydrate trong viên hoàn khi thay đổi dẫn tới bình quân mật độ khối lượng viên hoàn được phân làm 2 nhóm chính theo thứ tự tăng dần, cụ thể: 0,58
Hình 3.13. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ dextrin khác nhau
Hình 3.14. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ carboxymethyl cellulose khác nhau
Hình 3.15. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ đường mía khác nhau
Hình 3.16. Mật độ khối lượng của viên hoàn hoàn chứa carbohydrate nồng độ khác nhau
3.2.5. Độ đồng đều khối lượng của viên hoàn
Độ đồng đều về kích thước và phân bố đều các chất cấu trúc lên viên hoàn được đánh giá dựa trên độ đồng nhất khối lượng. Độ chính xác trong quá trình sản xuất viên hoàn được đánh giá dựa vào độ đồng nhất khối lượng viên hoàn [83].
Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn khác nhau khi sử dụng loại carbohydrate khác nhau và ở các hàm lượng khác nhau. Biên độ dao động của độ đồng nhất khối lượng viên hoàn giữa các lần đo trong cùng điều kiện về loại và hàm lượng carbohydrate luôn nhỏ hơn 12%, khi so sánh với trung bình giữa các lần đo. Tính toán độ đồng nhất khối lượng dựa trên khối lượng bình quân của viên hoàn được xắp xếp theo thứ tự giảm dần: 179,82, 141,20 và 125,92 mg tương ứng dextrin, đường mía và carboxylmethyl cellulose. Hàm lượng carbohydrate và loại carbohydrate ảnh hưởng lên độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn (p<0,05); đồng thời, sự tương tác giữa hàm lượng và loại carbohydrate cũng tác động lên độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn (p<0,05) (Hình 3.17 đến 3.20). Biên độ dao động khối lượng viên hoàn chứa các loại carbohydrate khác nhau là 0,33 –6,91, 0,29 –7,40, 0,14 –7,69, 0,1 – 8,39 và 0,46 –7,08, tương ứng với viên hoàn sử dụng 20, 25, 30, 35 và 40 % carbohydrate, điều này thể hiện khi so sánh với khối lượng trung bình của viên hoàn trong cùng điều kiện. Khi sử dụng cùng loại carbohydrate, biên độ dao động độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn được sắp xếp theo thứ tự tăng dần: dextrin, carboxylmethyl cellulose và đường mía, tương ứng lần lượt là 0,14 – 6,97, 0,29 – 7,69 và 0,33 – 9,07.
Kết quả thể hiện, độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn sử dụng dextrin là cao nhất, thấp nhất là đường mía.
Hình 3.17. Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ dextrin khác nhau
Hình 3.18. Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ carboxymethyl cellulose khác nhau
Hình 3.19. Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ đường mía khác nhau
Hình 3.20. Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn hoàn chứa carbohydrate nồng độ khác nhau
3.2.6. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất và hoạt tính
Khả năng giải phóng hoạt chất có mối tương quan lớn với thời gian phân rã, hữu ích trong kiểm soát quá trình hấp thu thực phẩm và thuốc trong cơ thể người. Trên cơ sở đặc tính cảm quan, hóa lý cũng như mục đích ứng dụng viên hoàn trong thực phẩm chức năng và dược phẩm, điều kiện sản xuất viên hoàn được lựa chọn sử dụng các loại tá dược khác nhau.
Viên hoàn sử dụng dextrin và đường mía với hàm lượng từ 20 tới 40 % đã thể hiện khả năng giải phóng hoạt chất và hoạt tính là 100 % trong thời gian 4 giờ nghiên cứu. Trong khi đó, khả năng giải phóng hoạt chất của viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose chỉ dao động trong khoảng 69,46 – 100 %. Viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose sở hữu khả năng giải phóng hoạt chất và hoạt tính thấp nhất so với các viên hoàn khác và cao nhất cũng chỉ bằng 69,46 % so với các viên hoàn khác. Khả năng giải phóng hoạt chất và hoạt tính bình quân của viên hoàn sử dụng 20 đến 40 % carboxymethyl cellulose tương ứng 71,91 – 100 % (Hình 3.21 và 3.22). Phân tích cho thấy, khả năng giải phóng hoạt chất và hoạt tính của viên hoàn bị tác động bởi hàm lượng và loại carbohydrate sử dụng (p<0,05). Khả năng giải phóng hoạt chất của viên hoàn và hàm lượng carboxymethyl cellulose được sử dụng tỷ lệ nghịch với nhau. Khả năng giải phóng hàm lượng polyphenol, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa giữa viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose và carbohydrate còn lại (dextrin và đường mía) là có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Hình 3.21. LN khả năng giải phóng hoạt chất của viên hoàn chứa loại và hàm lượng carbohydrate khác nhau
Hình 3.22. Khả năng giải phóng hàm lượng polyphenol và chlorophyll của viên hoàn chứa hàm lượng carboxymethyl cellulose khác nhau
3.3. ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA VIÊN HOÀN3.3.1. Độc tính cấp đường uống trên chuột 3.3.1. Độc tính cấp đường uống trên chuột
Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn, chuột lang đã được sử dụng để đánh giá độc tính, tuy nhiên, kỹ thuật nuôi giữ chuột lang chưa tốt, nên số lượng chuột lang mua về bị chết quá nửa, số con còn lại được dùng viên hoàn và không có biểu hiện bất thường về sức khỏe. Số lượng con sử dụng không đảm bảo về số lượng để đánh giá và phương pháp lấy máu chuột lang cũng không phù hợp nên máu bị hỏng, không sử dụng để đánh giá được. Nghiên cứu các quy định của nhà nước về đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn, thấy rằng, Quyết định số 141/QD-K2DT ngày 27/10/2015 của Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo, Bộ Y tế về hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc Đông y, thuốc từ Dược liệu, cho phép sử dụng thỏ hoặc chuột lang hoặc chuột swiss để đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn. Các kết quả đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên các đối tượng khác nhau này đều được đánh giá tương đương nhau. Do vậy, luận văn thực hiện đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên đối tượng chuột Swiss và hợp tác với đơn vị Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh để nghiên cứu.
Bảng 3.2. Cân nặng của chuột (g) thử độc tính cấp đường uống của viên hoàn Chuột thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Giới tính ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ ♀ Trọng lượng (g) 24,5 26,2 23,2 25,0 24,0 24,0 25,3 24,0 25,3 24,8 Thể tích cho uống (ml) 1,23 1,31 1,16 1,25 1,20 1,20 1,27 1,20 1,27 1,24 Tổng trọng lượng (g) 246,3
Tổng thể tích (ml) 12,32 Tổng lượng mẫu
(viên) 18,48
Liều cho uống
(viên/kg) 75 Số chuột thử nghiệm 10 Số chuột chết sau 72 giờ 0 Số chuột chết sau 14 ngày 0 Trọng lượng sau 24 giờ (g) 25,2 27,9 25,7 26,8 26,1 25,7 27,2 25,9 27,6 26,6 Trọng lượng sau 72 giờ (g) 28,6 30,6 28,1 30,4 29,4 28,6 30,5 27,4 29,7 28,4 Trọng lượng sau 7 ngày (g) 30,4 33,9 31,2 34,5 33,7 31,3 34,2 31,6 35,5 32,8 Trọng lượng sau 14 ngày (g) 33,3 35,2 37,4 39,6 37,1 35,7 38,4 34,8 39,6 35,3 Sau 14 ngày theo dõi không phát hiện được biểu hiện bất thường ở chuột về hành vi, trạng thái lông, chuột ăn uống và sinh hoạt bình thường. Trọng lượng cơ thể trung bình của chuột thí nghiệm tăng so với trọng lượng ban đầu lần lượt là 1,84, 4,54, 8,28 và 12,01 g tương ứng với sau 24 giờ, 72 giờ, 7 ngày, 14 ngày và không ghi nhận được bất cứ cá thể nào không tăng hoặc sút cân khi so với thời điểm kiểm tra trước đó. Chuột đã uống tới liều 50 ml/kg trọng lượng là liều tối đa có thể qua đường uống để đánh giá độc tính cấp của thuốc thử
nhưng không có chuột nào chết sau 14 ngày. Do đó, không xác định được LD50 của viên hoàn theo đường uống trên chuột. Như vậy, qua thử nghiệm cho thấy viên hoàn không gây độc tính cấp qua đường uống.
3.3.2. Độc tính bán trường diễn
3.3.2.1. Thông số sinh hóa máu ở chuột sinh lý trước thử nghiệm
Các thông số sinh hóa đánh giá hệ tạo máu, chức năng gan, thận ở chuột sinh lý trước thử nghiệm được trình bày trong Bảng 3.3. Trước khi thử nghiệm, chuột có giá trị trung bình chỉ số WBC (số lượng bạch cầu), RBC (lượng hồng cầu), HgB (huyết sắc tố), MCV (thể tích trung bình hồng cầu), MCH (huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MCHC (Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu), RDW (tỷ lệ phân bố hồng cầu) và PLT (số lượng tiểu cầu) lần lượt là 10,75
±0,84x109 /L, 8,33 ±0,18x1012 /L, 12,48 ±0,19 g/dL, 45,53 ±0,69 %, 54,70 ±0,99 fL, 14,98 ±0,30 pg, 27,39 ±0,19 g/dL, 17,67 ±0,28 % và 1314,10 ±60,18x109 /L. Các chỉ số sinh hóa đều nằm trong giới hạn chỉ số ở chuột bình thường theo đánh giá hệ tạo máu, chức năng gan, thận ở chuột sinh lý trước thử nghiệm.
Bảng 3.3. Thông số sinh hóa máu ở chuột sinh lý trước thử nghiệm
Thông số
Chuột trước thử nghiệm Chỉ số ở chuột bình thường Đực Cái Chung Công thức máu WBC (109/L) 10,76 ±1,31 10,74 ±1,19 10,75 ±0,84 3,0 – 28,2 RBC (1012/L) 8,53 ±0,08 8,14 ±0,34 8,33 ±0,18 5,0 – 9,5 HgB (g/dL) 12,54 ±0,33 12,42 ±0,24 12,48 ±0,19 10,9 – 16,3
HCT (%) 46,16 ±1,22 44,90 ±0,68 45,53 ±0,69 / MCV (fL) 54,20