3.3.1. Độc tính cấp đường uống trên chuột
Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn, chuột lang đã được sử dụng để đánh giá độc tính, tuy nhiên, kỹ thuật nuôi giữ chuột lang chưa tốt, nên số lượng chuột lang mua về bị chết quá nửa, số con còn lại được dùng viên hoàn và không có biểu hiện bất thường về sức khỏe. Số lượng con sử dụng không đảm bảo về số lượng để đánh giá và phương pháp lấy máu chuột lang cũng không phù hợp nên máu bị hỏng, không sử dụng để đánh giá được. Nghiên cứu các quy định của nhà nước về đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn, thấy rằng, Quyết định số 141/QD-K2DT ngày 27/10/2015 của Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo, Bộ Y tế về hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc Đông y, thuốc từ Dược liệu, cho phép sử dụng thỏ hoặc chuột lang hoặc chuột swiss để đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn. Các kết quả đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên các đối tượng khác nhau này đều được đánh giá tương đương nhau. Do vậy, luận văn thực hiện đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên đối tượng chuột Swiss và hợp tác với đơn vị Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh để nghiên cứu.
Bảng 3.2. Cân nặng của chuột (g) thử độc tính cấp đường uống của viên hoàn Chuột thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Giới tính ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ ♀ Trọng lượng (g) 24,5 26,2 23,2 25,0 24,0 24,0 25,3 24,0 25,3 24,8 Thể tích cho uống (ml) 1,23 1,31 1,16 1,25 1,20 1,20 1,27 1,20 1,27 1,24 Tổng trọng lượng (g) 246,3
Tổng thể tích (ml) 12,32 Tổng lượng mẫu
(viên) 18,48
Liều cho uống
(viên/kg) 75 Số chuột thử nghiệm 10 Số chuột chết sau 72 giờ 0 Số chuột chết sau 14 ngày 0 Trọng lượng sau 24 giờ (g) 25,2 27,9 25,7 26,8 26,1 25,7 27,2 25,9 27,6 26,6 Trọng lượng sau 72 giờ (g) 28,6 30,6 28,1 30,4 29,4 28,6 30,5 27,4 29,7 28,4 Trọng lượng sau 7 ngày (g) 30,4 33,9 31,2 34,5 33,7 31,3 34,2 31,6 35,5 32,8 Trọng lượng sau 14 ngày (g) 33,3 35,2 37,4 39,6 37,1 35,7 38,4 34,8 39,6 35,3 Sau 14 ngày theo dõi không phát hiện được biểu hiện bất thường ở chuột về hành vi, trạng thái lông, chuột ăn uống và sinh hoạt bình thường. Trọng lượng cơ thể trung bình của chuột thí nghiệm tăng so với trọng lượng ban đầu lần lượt là 1,84, 4,54, 8,28 và 12,01 g tương ứng với sau 24 giờ, 72 giờ, 7 ngày, 14 ngày và không ghi nhận được bất cứ cá thể nào không tăng hoặc sút cân khi so với thời điểm kiểm tra trước đó. Chuột đã uống tới liều 50 ml/kg trọng lượng là liều tối đa có thể qua đường uống để đánh giá độc tính cấp của thuốc thử
nhưng không có chuột nào chết sau 14 ngày. Do đó, không xác định được LD50 của viên hoàn theo đường uống trên chuột. Như vậy, qua thử nghiệm cho thấy viên hoàn không gây độc tính cấp qua đường uống.
3.3.2. Độc tính bán trường diễn
3.3.2.1. Thông số sinh hóa máu ở chuột sinh lý trước thử nghiệm
Các thông số sinh hóa đánh giá hệ tạo máu, chức năng gan, thận ở chuột sinh lý trước thử nghiệm được trình bày trong Bảng 3.3. Trước khi thử nghiệm, chuột có giá trị trung bình chỉ số WBC (số lượng bạch cầu), RBC (lượng hồng cầu), HgB (huyết sắc tố), MCV (thể tích trung bình hồng cầu), MCH (huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MCHC (Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu), RDW (tỷ lệ phân bố hồng cầu) và PLT (số lượng tiểu cầu) lần lượt là 10,75
±0,84x109 /L, 8,33 ±0,18x1012 /L, 12,48 ±0,19 g/dL, 45,53 ±0,69 %, 54,70 ±0,99 fL, 14,98 ±0,30 pg, 27,39 ±0,19 g/dL, 17,67 ±0,28 % và 1314,10 ±60,18x109 /L. Các chỉ số sinh hóa đều nằm trong giới hạn chỉ số ở chuột bình thường theo đánh giá hệ tạo máu, chức năng gan, thận ở chuột sinh lý trước thử nghiệm.
Bảng 3.3. Thông số sinh hóa máu ở chuột sinh lý trước thử nghiệm
Thông số
Chuột trước thử nghiệm Chỉ số ở chuột bình thường Đực Cái Chung Công thức máu WBC (109/L) 10,76 ±1,31 10,74 ±1,19 10,75 ±0,84 3,0 – 28,2 RBC (1012/L) 8,53 ±0,08 8,14 ±0,34 8,33 ±0,18 5,0 – 9,5 HgB (g/dL) 12,54 ±0,33 12,42 ±0,24 12,48 ±0,19 10,9 – 16,3
HCT (%) 46,16 ±1,22 44,90 ±0,68 45,53 ±0,69 / MCV (fL) 54,20 ±1,20 55,20 ±1,69 54,70 ±0,99 48,0 – 56,0 MCH (pg) 14,68 ±0,34 15,28 ±0,50 14,98 ±0,30 11,9 – 19,0 MCHC (g/dL) 27,12 ±0,31 27,66 ±0,18 27,39 ±0,19 25,9 – 35,1 RDW (%) 18,06 ±0,40 17,28 ±0,35 17,67 ±0,28 / PLT (109/L) 1355,20 ±76,60 1273,00 ±97,90 1314,10 ±60,18 / Chức năng gan – thận AST (U/L) 74,07 ±5,55 72,07 ±2,06 73,07 ±2,81 57 – 329 ALT (U/L) 39,72 ±3,14 38,16 ±1,40 38,94 ±1,64 7 – 227 Albumin (g/L) 37,58 ±0,51 37,64 ±0,54 37,61 ±0,35 25 – 54 Bilirubin TP (µM/L) 1,96 ±0,32 2,13 ±0,28 2,04 ±0,20 1,7 – 18,8 Cholesterol (mM/L) 2,17 ±0,10 2,30 ±0,07 2,23 ±0,06 0,9 – 5,7
Creatinin (µM/L) 26,14 ±1,42 26,74 ±1,30 26,44 ±0,91 8,8 – 185,7 Ure (mM/L) 6,21 ±0,37 6,47 ±0,45 6,34 ±0,28 0,7 – 25,4 3.3.2.2. Tình trạng chung và sự thay đổi cân nặng của chuột
Trong thời gian thí nghiệm, tất cả chuột ở các lô sống, hoạt động, ăn uống bình thường, lông mượt, không có hiện tượng rụng lông hoặc khô cứng lông, mắt sáng, phân khô, nước tiểu bình thường. Trọng lượng cơ thể của chuột trong quá trình thử nghiệm được trình bày ở Bảng 3.4. Khi so sánh cân nặng trung bình giữa lô liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến với lô chứng sinh lý tại các thời điểm sau 7, 14, 21, 28 ngày không thấy có sự khác biệt (p>0,05). Như vậy, viên hoàn với các mức liều và thời gian sử dụng trong thí nghiệm không ảnh hưởng tới tình trạng chung và sự phát triển cân nặng của chuột.
Bảng 3.4. Cân nặng trung bình của chuột thử nghiệm
Thời điểm
Cân nặng trung bình ± SEM (g) Lô Giới Sinh lý Viên hoàn 1 viên/kg Viên hoàn 3 viên/kg Ngày 0 Chung 23,23 ± 0,37 22,61 ± 0,43 23,18 ± 0,34 Đực 23,88 ± 0,44 22,95 ± 0,55 23,25 ± 0,60 Cái 22,58 ± 0,52 22,26 ± 0,68 23,10 ± 0,36 Ngày 7 Chung 26,55 ± 0,42 27,14 ± 0,43 26,70 ± 0,35 Đực 27,22 ± 0,47 27,61 ± 0,68 26,57 ± 0,49 Cái 25,87 ± 0,65 26,66 ± 0,51 26,82 ± 0,51
Ngày 14 Chung 29,94 ± 0,41 29,40 ± 0,60 29,59 ± 0,38 Đực 30,75 ± 0,32 29,87 ± 1,00 29,78 ± 0,64 Cái 29,12 ± 0,69 28,92 ± 0,68 29,40 ± 0,46 Ngày 21 Chung 31,63 ± 0,61 34,18 ± 1,32 33,39 ± 0,90 Đực 32,06 ± 0,83 36,32 ± 1,92 34,46 ± 0,86* Cái 31,20 ± 0,95 32,04 ± 1,35 32,32 ± 1,53 Ngày 28 Chung 34,75 ± 0,87 36,34 ± 1,62 36,17 ± 1,26 Đực 36,74 ± 0,92# 39,08 ± 2,01 38,36 ± 1,16 Cái 32,76 ± 0,76# 33,60 ± 2,00 33,98 ± 1,85
*: p < 0,05 khi so sánh với lô sinh lý cùng thời điểm
#p < 0,05 khi so sánh giữa 2 giới trong cùng lô 3.3.2.3. Ảnh hưởng lên các thông số huyết học
Ảnh hưởng lên số lượng bạch cầu
Sau 14 ngày
+ Chỉ số WBC của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến khi so với lô sinh lý khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
+ Chỉ số WBC của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều gấp 3 dự kiến giảm khi so sánh với lô sinh lý (p<0,05).
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở liều gấp 3 dự kiến cũng cho thấy có sự khác nhau (p<0,05).
Sau 28 ngày
+ Chỉ số WBC của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở liều gấp 3 dự kiến cũng cho thấy có sự khác nhau (p<0,05).
Như vậy, các chỉ số WBC của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học WBC của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thông số huyết học WBC của chuột thử nghiệm
Thông số WBC (109/L)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 9,20 ± 0,49 8,20 ± 0,41 10,20 ± 0,63 Viên hoàn 1 viên/kg 9,11 ± 0,76 10,16 ± 1,20 8,06 ± 0,78 Viên hoàn 3 viên/kg 6,92 ± 0,37** 6,06 ± 0,44*# 7,78 ± 0,25**#
Sau 28 ngày
Sinh lý 12,76 ± 0,86 13,28 ±,30 12,24 ± 1,23 Viên hoàn 1 viên/kg 14,15 ± 0,79 14,34 ± 0,83 13,96 ± 1,46 Viên hoàn 3 viên/kg 13,52 ± 0,60 14,78 ± 0,51# 12,26 ± 0,75#
*p < 0,05, **p < 0,01 khi so sánh với lô sinh lý ở cùng thời điểm
#p < 0,05 khi so sánh giữa 2 giới trong cùng lô
Ảnh hưởng lên số lượng hồng cầu
+ Chỉ số RBC của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Như vậy, các chỉ số RBC của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học RBC của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thông số huyết học RBC của chuột thử nghiệm
Thông số RBC (1012/L)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 9,14 ± 0,19 9,12 ± 0,34 9,15 ± 0,23 Viên hoàn 1 viên/kg 9,16 ± 0,20 9,23 ± 0,36 9,09 ± 0,22 Viên hoàn 3 viên/kg 9,55 ± 0,23 9,38 ± 0,33 9,72 ± 0,35 Sau
28 ngày
Sinh lý 9,26 ± 0,69 9,66 ± 0,31 8,87 ± 1,40 Viên hoàn 1 viên/kg 9,66 ± 0,19 9,90 ± 0,21 9,41 ± 0,30 Viên hoàn 3 viên/kg 8,71 ± 0,66 9,17 ± 0,90 8,24 ± 1,02
Ảnh hưởng lên lượng huyết sắc tố
Sau 14 ngày
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở liều dùng dự kiến cho thấy có sự khác biệt (p<0,05)
Sau 28 ngày
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
+ Chỉ số HgB của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Như vậy, các chỉ số HgB của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học HgB của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Thông số huyết học HgB của chuột thử nghiệm
Thông số HgB (g/dL)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 12,80 ± 0,37 13,28 ± 0,62 12,32 ± 0,34 Viên hoàn 1 viên/kg 13,33 ± 0,32 14,02 ± 0,23# 12,64 ± 0,40#
Viên hoàn 3 viên/kg 13,62 ± 0,40 13,72 ± 0,64 13,52 ± 0,55 Sau
28 ngày
Sinh lý 14,12 ± 0,24 13,84 ± 0,38 14,40 ± 0,26 Viên hoàn 1 viên/kg 13,76 ± 0,27 13,96 ± 0,37 13,56 ± 0,42 Viên hoàn 3 viên/kg 13,50 ± 0,24 13,66 ± 0,25 13,34 ± 0,42
#p < 0,05 khi so sánh giữa 2 giới trong cùng lô
Ảnh hưởng lên thể tích khối hồng cầu
Sau 14 ngày
+ Chỉ số HCT của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Sau 28 ngày
+ Chỉ số HCT của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến khi so với lô sinh lý, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
+ Chỉ số HCT của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều gấp 3 dự kiến giảm khi so sánh với lô sinh lý (p<0,05).
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt đều không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Như vậy, các chỉ số HCT của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học HCT của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Thông số huyết học HCT của chuột thử nghiệm
Thông số HCT (%)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 45,72 ± 1,50 47,60 ± 2,38 43,84 ± 1,63 Viên hoàn 1 viên/kg 44,42 ± 2,85 44,00 ± 5,87 44,84 ± 1,47 Viên hoàn 3 viên/kg 48,35 ± 1,73 48,90 ± 2,54 47,80 ± 2,62 Sau
28 ngày
Sinh lý 49,16 ± 3,21 50,36 ± 1,67 47,96 ± 6,54 Viên hoàn 1 viên/kg 51,14 ± 1,12 52,72 ± 1,22 49,56 ± 1,70 Viên hoàn 3 viên/kg 44,10 ± 2,52* 46,04 ± 4,60 42,16 ± 2,36
*p < 0,05 khi so sánh với lô sinh lý ở cùng thời điểm
Ảnh hưởng lên thể tích trung bình hồng cầu
Sau 14 ngày
+ Chỉ số MCV của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở liều dự kiến, cho thấy có sự khác nhau (p<0,05)
Sau 28 ngày
+ Chỉ số MCV của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến khi so với lô sinh lý, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
+ Chỉ số MCV của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều gấp 3 dự kiến giảm khi so sánh với lô sinh lý (p<0,05)
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm, khác biệt đều không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
Như vậy, các chỉ số MCV của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học MCV của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Thông số huyết học MCV của chuột thử nghiệm
Thông số MCV (fL)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 50,00 ± 1,27 52,20 ± 1,32 47,80 ±1,77 Viên hoàn 1 viên/kg 51,90 ± 1,02 54,40 ± 0,93# 49,40 ± 0,81#
Viên hoàn 3 viên/kg 50,60 ± 1,17 52,20 ± 1,36 49,00 ± 1,73 Sau
28 ngày
Sinh lý 54,00 ± 1,43 52,20 ± 0,92 55,80 ± 2,60 Viên hoàn 1 viên/kg 52,90 ± 0,85 53,20 ± 1,07 52,60 ± 1,44 Viên hoàn 3 viên/kg 52,20 ± 3,13** 50,00 ± 0,84 54,40 ± 6,41
**p < 0,01 khi so sánh với lô sinh lý ở cùng thời điểm
Ảnh hưởng lên huyết sắc tố trung bình hồng cầu
Sau 14 ngày
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở liều dùng dự kiến cho thấy có sự khác biệt (p<0,05)
Sau 28 ngày
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
+ Chỉ số MCH của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Như vậy, các chỉ số MCH của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học MCH của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Thông số huyết học MCH của chuột thử nghiệm
Thông số MCH (pg)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 14,01 ± 0,35 14,54 ± 0,36 13,48 ± 0,52 Viên hoàn 1 viên/kg 14,59 ± 0,36 15,28 ± 0,51# 13,90 ± 0,31#
Viên hoàn 3 viên/kg 14,28 ± 0,35 14,64 ± 0,44 13,92 ± 0,53 Sau
28 ngày
Sinh lý 17,00 ± 2,75 14,38 ± 0,35 19,62 ± 5,52 Viên hoàn 1 viên/kg 14,27 ± 0,33 14,12 ± 0,42 14,42 ± 0,55 Viên hoàn 3 viên/kg 16,85 ± 2,08 15,56 ± 1,77 18,14 ± 3,95
Ảnh hưởng lên nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu
+ Chỉ số MCHC của chuột thí nghiệm ở lô dùng liều dự kiến và liều gấp 3 dự kiến khi so với lô sinh lý sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
+ Khi so sánh chỉ số của chuột đực và chuột cái ở trong cùng một thí nghiệm sau 14 ngày và sau 28 ngày, khác biệt đều không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
Như vậy, các chỉ số MCHC của chuột thí nghiệm vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Thông số huyết học MCHC của chuột thử nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Thông số huyết học MCHC của chuột thử nghiệm
Thông số MCHC (g/dL)
Giới
Lô Chung Đực Cái
Sau 14 ngày
Sinh lý 28,01 ± 0,31 27,90 ± 0,30 28,12 ± 0,58 Viên hoàn 1 viên/kg 28,07 ± 0,34 28,02 ± 0,55 28,12 ± 0,46 Viên hoàn 3 viên/kg 28,21 ± 0,35 28,08 ± 0,33 28,34 ± 0,67