Biến độc lập Ký hiệu Phạm vi giá trị các biến
-1 0 1
Nồng độ NaOH (N) X1 -1 0 1
Thời gian xử lý (h) X2 -1 0 1
Tỉ lệ thể tích NaOH/ da cá (v/w) X3 -1 0 1
Tỷ lệ Hydroxyproline (Hyp)/protein (Y1) và hàm lượng chất béo còn lại so với chất khô (Y2, %) là hàm mục tiêu hay biến phụ thụ thuộc được biểu diễn theo phương trình hồi quy sau:
3 3 2 3
Yi= 0+ ∑ iXi + ∑ iiX2
i + ∑ ∑ ijXiXj
i=1 i=1 i j=i+1
Trong đó: Yi: là hàm mục tiêu; 0 là hằng số; i, ii, ij là hệ số bậc 1, bâc 2 và tương tác các biến độc lập trong phương trình hồi quy; Xi, Xj là biến độc lập.
2.3.2. Nghiên cứu quy trình thủy phân collagen da cá bằng enzyme
Trong nghiên cứu này, 3 loại enzyme đã được lựa chọn để khảo sát khả năng thủy phân collagen từ da cá ngừ. Da cá ngừ vây vàng giàu collagen được chuẩn bị theo các thông số kỹ thuật tìm được trong phần 2.2.1 được xay nhỏ bằng máy xay trục vít, kích thước lỗ xay 0,5 cm, sau đó chia thành từng túi nhỏ và trữ đông trước khi sử dụng.
Mẫu sau khi rã đông được tiến hành thí nghiệm theo Hình 2.5 để xác định điều kiện thủy phân theo từng enzyme với hàm mục tiêu là độ thủy phân (Degree of hydrolysis: DH) và hiệu suất thu hồi nitrogen (Nitrogen recovery: NR).
Da cá ngừ vây vàng giàu collagen
Khảo sát quá trình thủy phân collagen
của từng enzyme
Tối ưu hóa điều kiện thủy phân của enzyme
Enzyme Pepsin Enzyme Flavourzym e Enzyme Alcalase Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của thời gian
Chọn enzyme có độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitrogen cao nhất
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu quy trình tách chiết collagen thủy phân
2.3.2.1. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme pepsin
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme pepsin để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng. Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme pepsin 20 – 40NFU/g protein, nhiệt độ thủy phân 30 – 50 C, pH 1,5 – 3,0 và thời gian thủy phân 1 – 5 giờ. Khối lượng pepsin được tính dựa vào hoạt độ và hàm lượng protein trong mẫu. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme pepsin, tỷ lệ nước/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl nồng độ 1N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 C để phân tích các chỉ tiêu tiếp theo.
2.3.2.2. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme flavourzyme
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme flavourzyme để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng .Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme flavourzyme 10 – 50 LAPU/g protein, nhiệt độ thủy phân 30 – 60 C, pH 5,0 – 8,0 và thời gian thủy phân 2 – 8 giờ. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme flavourzyme, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl và NaOH nồng độ mỗi chất lần lượt là 1 N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0
– 4 oC để phân tích các chỉ tiêu tiếp theo.
2.3.2.3. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme alcalase để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng .Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme alcalase 2.5L PF 0,01 – 0,05 AU/g protein, nhiệt độ thủy phân 45 – 65 C, pH 6,0 – 9,0 và thời gian thủy phân 3 – 7giờ. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme alcalase 2.5L PF, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl và NaOH nồng độ mỗi chất lần lượt là 1 N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0
2.3.2.4. Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện thủy phân da cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase
Trước hết, dựa vào việc khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ ở mục
2.2.2.3 đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitrogen (NR) để xác định phạm vi của các biến độc lập như: Nhiệt độ thủy phân, pH, nồng độ enzyme alcalase và thời gian thủy phân. Sau đó, các tham số thủy phân được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Response surface method (RSM). Thiết kế Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng. Để xác định ảnh hưởng của các biến độc lập lên hàm mục tiêu, thiết kế Box-Behnken với 4 biến độc lập và được thể hiện ở 3 mức. Phạm vi và mức độ của biến độc lập được trình bày trong Bảng 2.2. Thí nghiệm được thiết kế với 4 yếu tố và 3 lần lặp lại ở điểm tâm. Sử dụng phần mềm JMP phiên bản 14.2 để phân tích bề mặt đáp ứng. Phần trăm độ thủy phân DH (Y1, %) và hiệu suất thu hồi nitrogen NR (Y2, %) được chọn là hàm mục tiêu. Các phương trình hồi quy được xác định theo công thức sau:
4 4 3 4
Yi= 0+ ∑ iXi + ∑ iiX2
i + ∑ ∑ ijXiXj
i=1 i=1 i j=i+1
Trong đó: Yi: hàm mục tiêu; o là hằng số; i, ii, ij hệ số bậc nhất, bậc hai và tương tác giữa các biến. Xi, Xj biến độc lập.