Biến độc lập Ký hiệu Phạm vi của biến
-1 0 1
Nhiệt độ thủy phân ( C) X1 -1 0 1
pH X2 -1 0 1
Nồng độ của enzyme alcalase (AU/g) X3 -1 0 1
Thời gian thủy phân (giờ) X4 -1 0 1
Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần
2.3.3. Tinh sạch và phân đoạn collagen thủy phân
Sơ đồ quy trình nghiên cứu tinh sạch và phân đoạn collagen được trình bày trong
Lọc sơ bộ
Bã
Dịch lọc Xác định thành phần: Chất khô, lipid, tro tổng, Nitơ tổng
Ly tâm Xác định khối lượng phân tử của các peptide collagen trong Tách các
dịch thủy phân để chọn màng
phân đoạn Dịch ly tâm
lọc
Tách và khảo sát tính chất (hòa tan, tạo nhũ, tạo bọt, chống oxi
Khảo sát tính chất (hòa tan,
hóa và chống đông) của các phân
tạo nhũ, tạo bọt, chống oxy đoạn collagen thủy phân
hóa và chống đông) của các phân đoạn collagen thủy phân
-Kiểm tra độ
Ảnh hưởng của nhiệt tinh sạch của
độ các phân
đoạn
Retentate - Khảo sát
Ảnh hưởng của áp Sản phẩm 2
Lọc màng
suất (SP2) (hòa tan, tạotính chất
nhũ, tạo bọt,
Ảnh hưởng của pH chống oxy
hóa và
Permeate chống đông)
Ảnh hưởng của lưu Sản phẩm 1 của các phân
lượng dòng nhập liệu (SP1) đoạn
Hình 2.6. Sơ đồ nghiên cứu quy trình tinh sạch và phân đoạn collagen
2.3.3.1. Xác định thành phần hóa học và phân bố khối lượng trong dịch sau ly tâm
Dịch collagen thủy phân sau khi ly tâm được xác định các thành phần hóa học như hàm lượng chất khô, lipid, tro tổng, nitơ tổng số và phân bố khối lượng phân tử của các peptide để làm cơ sở chọn màng lọc.
2.3.3.2. Làm sạch sơ bộ
Dịch collagen thủy phân được lọc qua giấy lọc Whatman (đường kính 180mm, lỗ lọc có kích thước 4-7 µm) bằng thiết bị lọc chân không. Dịch lọc thu được đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, trong 30 phút với nhiệt độ dịch đem ly tâm là
4 C. Loại bỏ phần chất rắn bên dưới lấy phần dịch bên trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.3.3. Phân đoạn collagen và khảo sát các hoạt tính của các phân đoạn
Sắc ký lọc gel (GPC) được dùng để tách các phân đoạn collagen ra khỏi phần dịch collagen thủy phân bằng cách hứng sản phẩm đầu ra của sắc ký theo thời gian lưu của các phân đoạn khi sắc ký. Các phân đoạn được kiểm tra các tính chất như khả năng hòa tan, khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, khả năng chống oxy hóa và chống đông.
2.3.3.4. Xác định điều kiện lọc màng
Thí nghiệm lọc màng được thực hiện trên thiết bị QuixStand Benchtop System (GE, Mỹ) với màng UFP-1-C-6 (GE, Mỹ) với chất liệu màng là polysulfone, chiều dài màng lọc 63,5 cm và đường kính trong hộp lọc 3,2 cm, kích thước lỗ lọc 1000 NMWC, điện tích màng lọc 0,48 m2. Quá trình lọc được thực hiện gián đoạn mỗi mẻ lọc là 3000 ml. Dịch collagen thủy phân trước khi đưa vào thí nghiệm lọc màng được làm sạch sơ bộ (mục 2.2.3.2) và xác định sự phân bố khối lượng phân tử của các peptide trong dịch collagen thủy phân bằng sắc ký lọc gel (mục 2.2.3.1). Trước khi lọc màng lọc được rửa bằng cồn 50 Vol và rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết cồn. Ổn định nhiệt cho nguyên liệu lọc bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức) trước khi bơm vào màng lọc.
a. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ dịch lọc là: 5 C; 10 C; 15 C; 20 C; 25 C; 30 C và 35 C. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng); pH 7,0, lưu lượng dòng
nhập liệu là 1,5 lít/phút, áp suất dòng vào là 10 psi, TMP 9 psi. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
b. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đầu vào
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở áp suất là: 6 psi; 8 psi; 10 psi; 12 psi và 14 psi. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng); pH 7,0, lưu lượng dòng nhập liệu là 1,5 lít/phút, đầu vào và đầu ra cột lọc luôn chênh lệch nhau 2 psi và nhiệt độ (đã xác định
ở mục a). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen
c. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở pH là: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng), lưu lượng dòng nhập liệu là 1,5 lít/phút và nhiệt độ, áp suất (đã xác định ở mục a, mục b). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
d. Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng nhập liệu
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở lưu lượng dòng nhập liệu là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 lít/phút. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng), nhiệt độ, áp suất và pH (đã xác định ở mục a, mục b và mục c). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
2.3.4. Ứng dụng collagen thủy phân vào thực phẩm
2.3.4.1. Ứng dụng phân đoạn (SP1) vào sản xuất nước uống chanh dây collagen Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ phối trộn nước
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ nước phối trộn với dịch quả chanh dây sao cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 2 kg chanh dây để sản xuất 2 lít nước uống chanh dây.
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ nước phối trộn: 30%; 35%; 40%; 45%; 50% và 55% so với dịch quả chanh dây.
Các yếu tố cố định:
+ Tỷ lệ collagen thủy phân 0,1% so với dịch quả chanh dây + Tỷ lệ axit citric 0,1% so với dịch chanh dây
+ Dung dịch siro 30% so với dịch quả chanh dây + Nhiệt độ thanh trùng 90 ºC, thời gian 20 phút Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Điểm cảm quan của sản phẩm
Thí nghiệm 2: Xác định tỷ lệ phối trộn axit citric
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ axit citric để cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 2 kg chanh dây để sản xuất 2 lít nước uống chanh dây.
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ axit citric phối trộn: 0.1%; 0.15%; 0.2%; 0.25%; và 0.3% so với dịch quả chanh dây
Các yếu tố cố định:
+ Tỷ lệ nước (Theo TN 1)
+ Tỷ lệ collagen thủy phân 0,1% so với dịch quả chanh dây + Dung dịch siro 30% so với dịch quả chanh dây
+ Nhiệt độ thanh trùng 90 C, thời gian 20 phút Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Điểm cảm quan của sản phẩm.
Thí nghiệm 3: Xác định tỷ lệ phối trộn dung dịch siro
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ phối trộn collagen thủy phân để cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 2 kg chanh dây để sản xuất 2 lít nước uống chanh dây.
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ siro phối trộn: 15%; 20%; 25%; 30% và 35% so với dịch quả chanh dây.
Các yếu tố cố định:
+ Tỷ lệ nước (Theo TN 1) + Tỷ lệ axit citric (theo TN2)
+ Tỷ lệ collagen thủy 0,1% so với dịch quả chanh dây + Nhiệt độ thanh trùng 90 C, thời gian 20 phút
Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Điểm cảm quan của sản phẩm.
Thí nghiệm 4: Xác định tỷ lệ phối trộn collagen thủy phân
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ phối trộn collagen thủy phân để cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 2 kg chanh dây để sản xuất 2 lít nước uống chanh dây.
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ collagen thủy phân phối trộn: 0%; 0,05%; 0,075%; 0,10%; 0,125% và 0,15%
- Các yếu tố cố định:
+ Tỷ lệ nước (Theo TN 1) + Tỷ lệ axit citric (theo TN2) + Tỷ lệ siro (theo TN3)
+ Nhiệt độ thanh trùng 90 C, thời gian 20 phút Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Điểm cảm quan của sản phẩm.
2.3.4.2. Ứng dụng phân đoạn (SP2) vào sản xuất sữa chua collagen Quy trình chế biến sữa chua thí nghiệm collagen Quy trình chế biến sữa chua thí nghiệm
Nguyên liệu Phối trộn Đồng hóa Thanh trùng Làm nguội Cấy giống Ủ mem Ủ lạnh Sản phẩm Bổ sung collagen thủy phân Men cái
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình sản xuất sữa chưa collagen
Thí nghiệm 1: Xác định thời gian lên men
Mục tiêu: Xác định thời gian lên men thích hợp để cho sản phẩm có pH, độ nhớt thích hợp và có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 1,5 lít sửa tươi không đường của Vinamilk
Yếu tố thí nghiệm: Thời gian lên men: 240 phút; 260 phút; 280 phút; 300
Các yếu tố cố định:
+ Sữa tươi không đường Vinamilk bổ sung sữa bột gầy (skim milk) để đạt hàm lượng chất khô là 15%.
+Men giống vi khuẩn lactic: chứa hai loại vi khuẩn lactic Streptococcus thermophilus và Lactobacillus delbrueckii subssp. Bulgaricus với tỉ lệ 2 : 1 + Tỷ lệ collagen thủy phân bổ sung là 0,1%
+ Đồng hóa bằng máy đồng hóa áp lực 200 bar, thanh trùng ở 95 C trong 5 phút, nhiệt độ lên men là 45 C.
Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: pH, độ nhớt và điểm cảm quan của sản phẩm. Thí nghiệm 2: Xác định tỷ lệ phối trộn collagen thủy phân
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ phối trộn collagen thủy phân để cho sản phẩm có pH, độ nhớt thích hợp và giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 1,5 lít sửa tươi không đường của Vinamilk
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ collagen thủy phân phối trộn: 0%; 0,05%; 0,075%;
0,10%; 0,125% và 0,15%
Các yếu tố cố định:
+Sữa tươi không đường Vinamilk bổ sung sữa bột gầy (skim milk) để đạt hàm lượng chất khô là 15%.
+ Thời gian lên men (theo thí nghiệm 1)
+ Men giống vi khuẩn lactic: chứa hai loại vi khuẩn lactic Streptococcus thermophilus và Lactobacillus delbrueckii subssp. Bulgaricus với tỉ lệ 2 : 1 + Đồng hóa bằng máy đồng hóa áp lục 200 bar, thanh trùng ở 95 C trong 5 phút, nhiệt độ lên men là 45 C.
Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: pH, độ nhớt và điểm cảm quan của sản phẩm. 2.4. Phương pháp phân tích
2.4.1. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý
- Hàm lượng protein, hàm lượng lipid, hàm lượng ẩm, tro được xác định lần lượt theo AOAC 2011.04: 2011, AOAC 960.39: 2012, AOAC 950.46: 2000, AOAC 920.153:2007
- Phân tích các kim loại nặng Pb, Hg, As theo AOAC 977.15: 2011, AOAC 971.21: 2010, AOAC 952.13:2010
- Phân tích axit amin bằng HPLC theo phương pháp của Stocchi và ctv, 1992 - Phân tích hàm lượng collagen HPLC theo phương pháp của ( Stocchi và ctv, 1992; Boran & Regenstein, 2009)
2.4.2. Phân tích vi sinh
- Phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) theo tiêu chuẩn AOAC 990.12: 1994 -Phân tích Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002
-Phân tích Escherichia coli theo tiêu chuẩn ISO 7251 – 2005
2.4.3. Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm
- Đánh giá cảm quan nước giải khát theo TCVN 3215-79 - Đánh giá cảm quan sữa chua theo TCVN 3215-79
- Cách huấn luyện hội đồng cảm quan theo TCVN 12389: 2018
2.4.4. Xác định các chỉ tiêu trong quá trình thủy phân-Xác định hiệu suất thu hồi nitrogen -Xác định hiệu suất thu hồi nitrogen
Hiệu suất thu hồi nitrogen (NR, %) =N1 x100
N2
N1: Nitrogen chứa trong collagen thủy phân (g); N2: Nitrogen trong da cá đã xử lý NaOH.
- Xác định độ thủy phân (DH, %)
Độ thủy phân collagen được xác định theo phương pháp của Nielsen và ctv, 2001.
-Xác định sự phân bố trọng lượng phân tử peptide của collagen thủy phân
Xác định sự phân bố trọng lượng phân tử (MW) của các peptide collagen thủy phân từ da cá ngừ vây vàng được đo bằng sắc ký lọc gel (GPC) theo phương pháp của Spellman và ctv, 2009.
-Tách các phân đoạn collagen thủy phân
Dựa vào sắc ký đồ GPC của dịch collagen thủy phân. Xác định thời gian lưu của các phân đoạn peptide để tách các phân đoạn ra khỏi dịch thủy phân bằng sắc ký lọc gel (GPC).
2.4.5. Phân tích một số chỉ tiêu trong quá trình lọc màng- Độ phân riêng - Độ phân riêng
-Thông lượng qua màng
Thông lượng qua màng được xác định theo phương pháp của Shishegaran và ctv, 2020.
- Hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi được xác định theo phương pháp của Gifuni và ctv, 2020
2.4.6. Phân tích một số tính chất của collagen thủy phân-Xác định độ hòa tan -Xác định độ hòa tan
Độ hòa tan của các phân đoạn collagen thủy phân được xác định dựa trên phương pháp được mô tả bởi Tsumura và ctv (2005) với một số điều chỉnh.
- Xác định khả năng tạo nhũ của collagen thủy phân
Tính chất tạo nhũ gồm hoạt tính tạo nhũ (EAI:Emulsifying activity index) và độ bền nhũ (ESI: Emulsifying stability index) được xác định dựa trên phương pháp của Pearce và Kinsella (Pearce & Kinsella, 1978; Zamorano- Apodaca và ctv, 2020).
-Xác định khả năng tạo bọt của của collagen thủy phân
Khả năng tạo bọt (FC: Foaming capacity và độ bền bọt (FS: Foaming stability) được xác định dựa trên phương pháp của Shahidi và ctv.(Shahidi và ctv, 1995; Zamorano-Apodaca và ctv, 2020)
- Xác định khả năng chống oxy hóa
+ Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của (Hui-Yin, 2002).
+Năng lực khử được xác định theo phương pháp pháp của Wang và ctv, 2012). + Xác định khả năng chống oxy hóa trên môi trường dầu-nước theo phương
pháp của Zhao và ctv, 2012
- Xác định khả năng chống đông của collagen thủy phân
Khả năng chống đông của collagen thủy phân theo phương pháp của Wu và ctv, 2018.
2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu thí nghiệm
Số liệu thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm JMP phiên bản 14.2. Sự thích ứng của mô hình dựa trên các thông số Lack of fit, hệ số xác định (R2) và giá trị kiểm tra Fisher (F-value) thu được từ phân tích phương sai (ANOVA). Việc kiểm tra ý nghĩa thống kê với độ tin cậy là 95%. Các sơ đồ không gian ba chiều (3D) và hai chiều (2D) của hàm mục tiêu bằng cách thay đổi hai biến độc lập trong phạm vi thí nghiệm và giữ một biến tại điểm tâm. Vẽ đồ thị bằng Microsoft Excel 2016.
Các giá trị trung bình khác nhau của các phản ứng đo lường và dự đoán được phân tích bằng phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm SPSS phiên bản 25.0.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu xử lý phi collagen từ da cá ngừ vây vàng 3.1.1. Thành phần hóa học của da cá ngừ vây vàng
Thành phần chủ yếu của da cá ngừ vây vàng là độ ẩm, tro, collagen, lipid và protein được trình bày trong Bảng 3.1. Trong đó ẩm độ chiếm tỷ lệ cao nhất với 63,59%, protein chiếm 32,02% cao hơn hàm lượng protein trong da cá tra và da cá mập (Quỳnh & Đào, 2015).