3. Nội dung nghiên cứu gồm
1.4. Nested PCR trong chẩn đoán H.pylori
1.4.1. Khái niệm về Nested PCR
Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA. Phản ứng Nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định.
So với PCR thông thường, Nested PCR làm tăng tính đặc hiệu là do sự bắt cặp của primer thứ hai với đoạn gen được nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất. Nếu ban đầu khuôn DNA bị khuếch đại sai thì khả năng khuếch đại ở lần thứ hai sẽ rất thấp. Nested PCR làm tăng độ nhạy cho phép phát hiện các mẫu có lượng DNA rất thấp so với PCR truyền thống.
Hình 1.7. Nested PCR
Nhược điểm lớn nhất của Nested PCR là gia tăng mức độ tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR. Tuy nhiên, có thể khắc phục bằng cách cải tiến chạy Nested PCR trong một ống duy nhất.
1.4.2.Ứng dụng củaNested PCR trong chẩn đoán H. pylori
PCR không chỉ được sử dụng để phát hiện vi khuẩn mà còn đặc trưng cho các gen gây bệnh và các đột biến đặc hiệu liên quan đến kháng kháng sinh. Các gen được bảo tồn sử dụng để phát hiện H. pylori là operon urease: urea
và glmM , còn được gọi là ureC hoặc 16S rRNA , 23S rRNA và Hsp60 gen, cần phải biết trình tự DNA của gen mục tiêu trong bao nhiêu chủng H. pylori
và các loài vi khuẩn liên quan khác để có thể thiết kế các mồi cụ thể. Gen 16S rRNA được bảo tồn cao ở vi khuẩn biểu hiện bởi các loài Helicobacter khác nhau. Bộ khuếch đại 109bp đặc hiệu cho H. pylori 16S rRNA cũng đã được quan sát thấy đôi khi được khuếch đại trong các mô của con người, do đó ảnh hưởng đến chẩn đoán H. pylori. Các gen khác có chức năng chưa biết, ví dụ: protein 26-kDa, được xác định là ssaA hoặc các chuỗi ngẫu nhiên cũng đã được sử dụng.
gen độc hại và khá phổ biến ở các quốc gia Đông Á. Tuy nhiên, tất cả các chủng có thể không có gen CagA dẫn đến giảm độ nhạy của H. pylori thường bị hạn chế ở đường tiêu hóa-miệng, PCR không được thực hiện trong mẫu máu hoặc huyết thanh. Có những báo cáo cho thấy sự hiện diện của H. pylori DNA cụ thể trong các mẫu bệnh phẩm này, nhắm mục tiêu gen cụ thể (C97 và C98) và khu vực được bảo tồn của gen VacA. Hơn nữa, các kỹ thuật dựa trên PCR đã được sử dụng rất thành công trong các mẫu phân và nước bọt.
Có nhiều sửa đổi của công nghệ PCR để tăng độ nhạy phát hiện. Việc sử dụng Nested PCR hoặc đã được thử nghiệm đã được đề xuất sử dụng gen mồi nội bộ nhắm mục tiêu gen được bảo tồn (protein sốc nhiệt; Hsp60 ) và tăng độ đặc hiệu và độ nhạy lên đến 100%. Ngoài ra, PCR thứ hai cũng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng cùng một mồi. Nếu sử dụng kỹ thuật PCR một bước, nó sẽ phát hiện 70 tế bào vi khuẩn trong mẫu sinh thiết. Hơn nữa, các cặp mồi cho Nested PCR được sử dụng có thể phát hiện tối thiểu 30ng DNA mẫu trên khuếch đại sơ cấp và 1fg (tương ứng với khoảng 3 sinh vật) sau các chu kỳ khuếch đại lồng nhau [9].
Tính đặc hiệu dựa trên PCR của H. pylori là một vấn đề khác, đặc biệt là trong các mẫu sinh học được thu thập từ các vị trí khác ngoài dạ dày. Theo một số tác giả cho rằng mẫu bệnh phẩm nên được chỉ định dương tính với H. pylori khi có sự khuếch đại của hai gen mục tiêu được bảo tồn khác nhau. Mặt khác, Nested PCR có thể được sử dụng để giải quyết vấn đề về tính đặc hiệu, nhắm mục tiêu các loài Pseudomonas khuếch đại gen Hsp60 trong các mẫu sinh thiết [10].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn H. pylori ký hiệu là H.p1091 do viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Các chủng được lữu trữ trong điều kiện -80°C tại Phòng thí nghiệm Y sinh - Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
- Tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm là dịch dạ dày thu nhận từ 35 bệnh nhân được chỉ định nội soi do nghi có tổn thương viêm hoặc loét dạ dày tá tràng và dịch được đến khám tại một số bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên. Tất cả các bệnh nhân đều được biết thông tin và mục tiêu nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị
Hóa chất: Các hoá chất dùng trong tách chiết DNA tổng số, PCR, điện di PCR được cung cấp bởi Qiagen, Sigma, Thermal Scientific.
Primer: Ðược thiết kế để nhân lên đặc hiệu đoạn DNA do công ty Phusachemistry cung cấp.
Dụng cụ thiết bị nghiên cứu gồm:
+ Máy ly tâm (Hettich), tủ lạnh sâu -20°C. + Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher).
+ Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabine (Esco), Máy vortex. + Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl, máy PCR (Bio-rad).
Các dụng cụ khác:
- Tube đựng bệnh phẩm 15ml, 50ml. - Đầu côn có lọc 10µl, 100 µl, 1000 µl.
- Giấy thấm, giấy xét nghiệm, sổ lưu kết quả xét nghiệm. - Bút viết kính, bút bi, mũ, khẩu trang.
- Găng không có bột. - Quần áo bảo hộ.
- Dung dịch nước rửa tay, cồn sát trùng tay nhanh, dung dịch khử trùng. - Khăn lau tay.
- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR.
2.2. Địa điểm và thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Y Sinh - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2018 đến tháng 9/2019.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày
Mẫu bệnh phẩm là dịch dạ dày thu nhận từ bệnh nhân được chỉ định nội soi do nghi có tổn thương viêm hoặc loét dạ dày tá tràng để chẩn đoán vi khuẩn. Quá trình hút dùng dây vô trùng luồn cùng dây dẫn nội soi để hút các dịch trong các ổ loét của dạ dày. Sau đó chuyển dịch vào ống vô trùng mang đến phòng thí nghiệm lưu giữ ở 2 - 8°C trước khi tách chiết. Loại bỏ những mẫu không đủ lượng dịch (dưới 2ml).
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm
Quy trình tách DNA vi khuẩn từ dịch dạ dày sử dụng QIAMP DNA MINI KIT (Cat No./ID: 51304) của Qiagen, gồm các bước như sau:
Bước 1: Lấy 4 ml dịch vị dạ dày chia đều ra 4 ống eppendorf loại 2 ml (1ml/ống). Đánh số thứ tự cho từng ống. Thêm vào mỗi ống 1ml Tris 0,67M. Ly tâm 10.000 rpm trong 20 phút
Bước 2: Loại bỏ dịch nổi. Thêm 200 µl nước khử ion vào ống số 1, mix đều. Hút toàn bộ dịch sang ống số 2, mix đều. Hút dịch sang ống số 3, mix đều. Hút dịch sang ống số 4. Mix đều.
Bước 3: Hút dịch sang ống eppendorf loại 2ml mới. Thêm 5 µl proteinase K (~20mg/ml).Vontex 15s. Thêm 200 µl AL buffer.
Bước 4: Ủ ở 56oC trong 15 phút. Spin nhẹ. Thêm cồn tuyệt đối tỉ lệ 1:1 với mẫu. Vontex 15s. Spin nhẹ. Để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bước 5: Hút dịch lên cột kit. Đóng nắp, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch. Thêm 500 µl buffer AW1. Ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch.
Bước 6: Thêm 500 µl buffer AW2. Ly tâm 12 000 rpm trong 4 phút. Bỏ dịch. Ly tâm 12.000 rpm trong 2 phút. Bỏ dịch.
Bước 7: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 200 µl nước khử ion hoặc buffer AE. Để ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Bỏ cột. Thu dịch. Bảo quản ở -20oC.
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu chủng vi khuẩn
Từ chủng đối chứng (chủng phân lập) phương pháp tách chiết được thể hiện ở các bước sau:
Bước 1: Hút 330 µl vi khuẩn vào ống eppendorf sau đó li tâm 8.000rpm trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi để lại cặn vi khuẩn.
Bước 2: Bổ sung 180 µl Digestion solution + 20 µl proteinase K. Ủ ở 56oC trong 30 phút (cách 5 phút votex vài lần trong lúc ủ).
Bước 4: Thêm 200 µl Lysis solution. Votex 15s
Bước 5: Thêm vào 400 µl 50% ethanol. Trộn đều bằng pipet hoặc votex Bước 6: Hút dịch lên cột kit. Đóng nắp, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch.
Bước 7: Thêm 500 µl Wash buffer I. Ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch. Bước 8: Thêm 500 µl Wash buffer II. Ly tâm tối đa 14.500 rpm trong 3 phút, bỏ dịch. Ly tâm tiếp 1 phút 14.500 rpm, bỏ dịch.
Bước 9: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Mở nắp cột nhẹ nhàng và thêm 100 µl Elution buffer ủ 2 phút. Ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Bỏ cột, thu dịch. Bảo quản ở -20oC.
2.3.4. Phương pháp đo DNA tổng số
Để đo nồng độ DNA quá trình đo được thực hiện trên máy Nano drop ở các bước sau:
- Bước 1: Khởi động hệ thống máy. - Bước 2: Chọn chế độ DS DNA. - Bước 3: Đo blank.
- Bước 4: Hút 2 µl mẫu đưa vào máy đo.
- Bước 5: Xác định A260/A280 và A260/A230.
2.3.5. Phương pháp Nested PCR
2.3.5.1. Phát hiện đoạn DNA đặc hiệu genome H. pylori
Để phát hiện đoạn DNA đặc hiệu genome H. pylori, 2 cặp mồi được thiết kế cho phản ứng Nested PCR gồm: cặp mồi thứ nhất HpF1 và HpR1 khuếch đại đoạn DNA vòng ngoài kích thước khoảng 417 nucleotide. Cặp mồi thứ 2
HpF2 và HpR2 khuếch đại đoạn DNA vòng trong kích thước dự kiến 230 nucleotide.
Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR TT Tên Trình tự (5’----3’) Nồng độ (pmo l/µl) Sản phẩm Nguồn gốc 1 HpF1 5’-CCCTCACGCCATCAGTCCCAAAAA-3’ 10 417 bp Yamada et al. 2008 HpR1 5’-AAGAAGTCAAAAACGCCCCAAAAC-3’ 10 2 HpF2 5’-GGCAAATCATAAGTCCGCAGAA-3’ 10 230 bp HpR2 5’-TGAGACTTTCCTAGAAGCGGTGTT-3’ 10 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR vòng 1 TT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 phản ứng 1 DNA 8
2 PCR master mix Buffer 25
3 Primer 1F (10pmol/µl) 2 4 Primer 1R(10pmol/µl) 2 5 H2O khử ion 13 Tổng 50 Sản phẩm PCR lần 1 sẽ là mẫu cho PCR lần 2. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cho vòng 2 TT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 phản ứng 1 DNA 8
2 PCR master mix Buffer 25
3 Primer 2F ((10pmol/µl) 2
4 Primer 2R(10pmol/µl) 2
5 H2O khử ion 13
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
94 oC 5 phút 1 94 oC 1 phút 30 giây 30 55oC 1 phút 30 giây 72 oC 1 phút 30 giây 72 oC 5 phút 1 4 oC ∞
2.3.5.2. Phát hiện các chủng H. pylori mang gen CagA
Để phát hiện đoạn DNA đặc hiệu gen CagA, 2 cặp mồi được thiết kế cho phản ứng Nested PCR gồm: cặp mồi thứ nhất HpCagAF1 và HpCagAR1 khuếch đại đoạn DNA vòng ngoài kích thước khoảng 430 nucleotide. Cặp mồi thứ 2 khuếch đại đoạn DNA vòng trong HpCagAF1 và HpCagAR2 kích thước dự kiến 420 nucleotide.
Bảng 2.5. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR phát hiện gen CagA TT Tên Trình tự (5’----3’) Nồng độ (pmol/ µl) Sản phẩm Nguồ n gốc 1 HpF1 5'-GGAACCCTAGTCAGTAAT GGGTT-3' 10 430 bp (vòng 1) Hirai et al. 2009 HpR1 5'-GCTTTAGCTTCTGATACC GCTTGA-3' 10 2 HpF1 5'-GGAACCCTAGTCAGTAAT GGGTT-3' 10 420 bp HpR2 5'-AATTCTTGTTCCCTTGAA AGCCC-3' 10
2)
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR cho 2 vòng
TT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 phản ứng Phản ứng vòng 1 Phản ứng vòng 2
1 DNA 2 5
2 PCR master mix Buffer 25 25
3 Primer 2F (10 pmol/µl) 2 2
4 Primer 2R (10 pmol/µl) 2 2
5 H2O khử ion 19 16
Tổng 50 50
Trong đó, PCR vòng 2 sẽ sử dụng DNA khuôn là sản phẩm PCR vòng 1. Các cặp mồi cho mỗi vòng được trình bày 2.5.
Bảng 2.7. Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
94 oC 5 phút 1 94 oC 1 phút 30 giây 30 55oC 1 phút 30 giây 72 oC 1 phút 30 giây 72 oC 5 phút 1 4oC ∞
2.3.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose:
- Thêm đệm TAE 1X vào bình, lắc đều.
- Đun sôi đến agarose tan hoàn toàn, để ấm đến 60oC rồi đổ vào khay gel. - Để nhiệt độ phòng 30 phút để gel ổn định.
Điện di:
- Đặt gel vào khay điện di, đổ đầy đệm chạy và rút lược từ từ ra khỏi gel để tránh vỡ giếng.
- Trộn 12µl DNA với 2dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel. Điện di trong khoảng 30-40 phút, 110V
- Nhuộm bản gel với dung dịch Ethidium bromide trong 5 phút và soi, chụp ảnh trên đèn soi gel UV.
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và nhóm kiểm định theo Mann – Whisney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori và dịch dạ dày
Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số là bước quan trọng trong quá trình phân lập một đoạn gen vì kết quả của quá trình này ảnh hưởng rất lớn đến các thí nghiệm.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số: (A) từ các chủng chuẩn, (B) từ các mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày
Kết quả tách chiết DNA tổng số được trình bày trong hình 3.1 và bảng 3.1. Từ kết quả phân tích phổ hấp thụ trong hình 3.1A và 3.1B cho thấy rằng, DNA thu nhận được từ các chủng chuẩn có đỉnh hấp phụ duy nhất ở bước sóng khoảng 260nm. Đây là bước sóng hấp phụ cực đại của DNA (hình 3.1A). Phổ hấp phụ trình bày trong hình 3.1B của các mẫu bệnh phẩm lại cho thấy không có đỉnh duy nhất ở bước sóng 260nm. Đỉnh hấp phụ thấp và nằm trong khoảng từ 260 – 290nm. Điều này có thể cho thấy rằng, mẫu DNA có lẫn nhiều tạp chất đặc biệt là các protein. Các dữ liệu trình bày trong bảng 3.1 đã cho thấy rất rõ các mẫu bệnh phẩm (ký hiệu BN1-BN6) có nồng độ DNA thu được rất thấp, dao động từ 5 -12ng/µl (trong tổng thể tích thu được là 20µl tách từ 2ml dịch dạ dày). Đáng chú ý, tỷ số OD ở bước sóng A260/A280 chỉ đạt từ 0,87 - 0,94. Trong khi đó các mẫu đối chứng là các chủng H. pylori nuôi cấy có hàm lượng DNA tổng số đạt từ 99 - 125,5ng/µl (tổng thể tích DNA thu được là 30 µl từ 0,5 ml dịch nuôi cấy).
Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm và chủng H. pylori đối chứng
Kết quả này chỉ ra rằng, DNA thu nhận từ dịch dạ dày là rất thấp cả về số lượng (nồng độ) và chất lượng (độ tinh sạch) so với DNA tách chiết từ các
chủng đã phân lập bằng nuôi cấy. Những khó khăn trong việc thu nhận DNA tổng số chứa DNA của H. pylori từ dịch dạ dày có thể được giải thích bởi môi trường trong dạ dày là môi trường HCl, đồng thời dịch dạ dày chứa rất nhiều các thành phần tạp chất từ thức ăn. HCl có thể làm thay đổi tính chất của các chất dùng để tách chiết DNA. Cùng với đó, dạ dày chứa rất nhiều enzyme pesin. Điều này cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tinh sạch DNA trong quá trình tách chiết. Thêm vào đó, hầu hết các H. plylori bám trên bề mặt của niêm mạc dạ dày hoặc chui vào lớp tế bào biểu mô dạ dày nên tỷ lệ H. pylori trong dịch dạ dày cũng thấp. Tuy nhiên, nó vẫn được cho là cao hơn trong các mẫu phân và mẫu nước bọt.
3.2. Khuếch đại DNA đặc trưng genome của H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR Nested PCR
Từ các mẫu DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày và