3. Nội dung nghiên cứu gồm
3.5. Xây dựng quy trình chẩn đoán ở mức độ phòng thí nghiệm
Quy trình thực hiện phản ứng Nested PCR và áp dụng chẩn đoán ở mức phòng thí nghiệm. Bước đầu chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật này để chẩn đoán ở 35 mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày của bệnh nhân.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất một quy trình chung để chẩn đoán cho các mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày ở mức độ phòng thí nghiệm gồm các bước sau:
- Bước 1: Thu nhận mẫu bệnh phẩm đưa về phòng xét nghiệm
- Bước 2: Ly tâm thu cặn tế bào. Tách chiết DNA trực tiếp bệnh phẩm của bệnh nhân theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất Qiagen.
- Bước 3: Đo DNA trên mát quang phổ Nanodrop
- Bước 4: Với mỗi mẫu bệnh phẩm, tiến hành kiểm tra chạy 2 vòng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt.
tích các băng DNA xuất hiện để xác định xem mẫu bệnh phẩm có dương tính với vi khuẩn H. pylori hay không, và nếu dương tính thì có mang gen CagA hay không. Toàn bộ quy trình chẩn đoán được thực hiện sơ đồ hóa trong hình như sau:
Hình 3.9. Quy trình chẩn đoán H. pylori bằng phương pháp Nested PCR áp dụng cho các phòng thí nghiệm
PCR lần 2 (cho đoạn DNA đặc trưng của H. pylori và gen CagA) Lấy mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày thông qua
nội soi từ các bệnh nhân
Đo DNA trên máy quang phổ Nanodrop
PCR lần 1 (cho đoạn DNA đặc trưng của H. pylori và gen CagA)
Ly tâm thu cặn tế bào,
Tách chiết DNA bằng bộ kit Qiagen mini kit
Điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1. Đã tách chiết được DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm và từ chủng đối chứng, trong đó, mẫu bệnh phẩm thu được hàm lượng DNA thấp, độ tinh sạch cũng rất thấp (tỷ số 260/280 từ 0,87-0,94).
2. Đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn H. pylori trong mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng Nested-PCR.
3. Đã xác định được sự có mặt của gen CagA ở các mẫu vi khuẩn H.pylori
dương tính trong mẫu bệnh phẩm bằng Nested PCR.
4. Phân tích trên 35 mẫu bệnh phẩm đã chỉ ra tỷ lệ dương tính với H. pylori
là 85,7%, tỷ lệ dương tính với gen CagA là 90%.
5. Thiết lập được quy trình (sơ đồ) chẩn đoán H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR. Đối với phương pháp Nested PCR có thể xác định sớm được vi khuẩn H. pylori chỉ với lượng vi khuẩn rất nhỏ.
2. Kiến nghị
Ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR từ dịch dạ dày.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Việt Hà (2013), "Tìm hiểu mối liên quan giữa số lượng vi khuẩn với biểu hiện lâm sàng, nội soi và mô bệnh học ở bệnh nhân viêm, loét dạ dày tá tràng do Helicobacter pylori.", Tạp chí y học thực hành. 2, pp. 89-92.
2. Vũ Minh Hoàn, Nguyễn Trọng Thông và Vũ Thị Ngọc Thanh (2012), "Nghiên cứu độc tính cấp và ảnh hưởng của cao Vị quản khang đối với thể trạng và hệ thống tạo máu ở động vật thực nghiệm", Tạp chí Y học thực hành. 8(838), p. 10.
3. Nguyễn Gia Khánh và Nguyễn Văn Bàng (2009), "Nhiễm Helicobacter pylori ở trẻ em, lâm sàng và điều trị", Nhà xuất bản y học, pp. 128-155. 4. Nguyễn Văn Ngoan (2004), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô
bệnh học và kết quả điều trị viêm dạ dày mạn tính có nhiễm Helicobacter pylori ở trẻ em", Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
5. Nguyễn Hoài Chân, Nguyễn Gia Khánh, Phạm Thị Thu Hương (2012), "Nghiên cứu một số đặc điểm nội soi và tổn thương mô bệnh học ở trẻ em đau bụng tái diễn có hội chứng dạ dày - tá tràng", Tạp chí Nhi khoa. 5(3), pp. 20-25.
Tài liệu tiếng Anh
6. Abe. T et al. (2011), "Impact of Helicobacter pylori CagA diversity on gastric mucosal damage: an immunohistochemical study of East-Asian- type CagA", J Gastroenterol Hepatol. 26(4), pp. 688-93.
7. Backert. S and Tegtmeyer. N (2017), "Type IV Secretion and Signal Transduction of Helicobacter pylori CagA through Interactions with Host Cell Receptors", Toxins (Basel). 9(4).
8. Bhatti. T. R et al. (2011), "Lymphocytic gastritis in pediatric celiac disease", Pediatr Dev Pathol. 14(4), pp. 280-3.
9. Carmack. Sw et al. (2009), "Lymphocytic disorders of the gastrointestinal tract: a review for the practicing pathologist", Adv Anat Pathol. 16(5), pp. 290-306. doi 10.1097/PAP.0b013e3181b5073a.
10. Delgado. J. S, Landa. E, and Ben-Dor. D (2013), "Granulomatous gastritis and Helicobacter pylori infection", Isr Med Assoc J. 15(6), pp. 317-8. 11. Digestives, Infections J Gut (2002), "Risk factors for atrophic chronic
gastritis in a European population: results of the Eurohepygast study". 50, pp. 779-785.
12. Dolak Werner et al. (2017), "A multicenter prospective study on the diagnostic performance of a new liquid rapid urease test for the diagnosis of Helicobacter pylori infection", Gut Pathogens. 9, p. 78.
13. Drumm Brendan et al. (2000), "Helicobacter pylori infection in children: a consensus statement", Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 30(2), pp. 207-213.
14. Du. Y et al. (2006), "Helicobacter pylori and Schistosoma japonicum co- infection in a Chinese population: helminth infection alters humoral responses to H. pylori and serum pepsinogen I/II ratio", Microbes Infect. 8(1), pp. 52-60.
15. El Demellawy. D, Otero. C, and Radhi. J (2009), "Primary gastric lymphoma with florid granulomatous reaction", J Gastrointestin Liver Dis. 18(1), pp. 99-101.
16. Elitsur Yoram et al. (2008), "Does Helicobacter pylori protect children from reflux disease?", Journal of clinical gastroenterology. 42(2), pp. 215-216.
17. Fox. J. G et al. (2007), "Accelerated progression of gastritis to dysplasia in the pyloric antrum of TFF2 -/- C57BL6 x Sv129 Helicobacter pylori- infected mice", Am J Pathol. 171(5), pp. 1520-8.
18. Fuentebella. J et al. (2009), "Abdominal pain, gastrointestinal bleeding, and weight loss in a 17-year-old male", Dig Dis Sci. 54(4), pp. 722-4. 19. Gall. A et al. (2017), "TIFA Signaling in Gastric Epithelial Cells Initiates
20. Gilani Ali et al. (2017), "VacA and CagA genotypes status and antimicrobial resistance properties of Helicobacter pylori strains isolated from meat products in Isfahan province, Iran". 18(2), p. 97.
21. Goodwin. CS and Armstrong. JA (1990), "Microbiological aspects of
Helicobacter pylori (Campylobacter pylori)", European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 9(1), pp. 1-13.
22. Han. S. H, Joo. M, and Kim. K. M. (2013), "High proportion of granzyme B+ intraepithelial lymphocytes contributes to epithelial apoptosis in
Helicobacter pylori - associated lymphocytic gastritis", Helicobacter. 18(4), pp. 290-8.
23. Haot. J et al. (1990), "Lymphocytic gastritis--prospective study of its relationship with varioliform gastritis", Gut. 31(3), pp. 282-5.
24. Hatakeyama Masanori (2017), "Structure and function of Helicobacter pylori CagA, the first-identified bacterial protein involved in human cancer", Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 93(4), pp. 196-219.
25. Hayashi. T et al. (2017), "Differential Mechanisms for SHP2 Binding and Activation Are Exploited by Geographically Distinct Helicobacter pylori CagA Oncoproteins", Cell Rep. 20(12), pp. 2876-2890.
26. Hirai Itaru et al. (2009), "A method for assessment of Helicobacter pylori
genotype using stool specimens". 56(1), pp. 63-66.
27. Inagaki-Ohara. K et al. (1997), "Potential for involvement of Fas antigen/Fas ligand interaction in apoptosis of epithelial cells by intraepithelial lymphocytes in murine small intestine", Lab Invest. 77(5), pp. 421-9.
28. Ismail Hawazen et al. (2016), "A newly developed nested PCR assay for the detection of Helicobacter pylori in the oral cavity". 50(1), pp. 17-22. 29. Ji Rui et al. (2010), "Confocal laser endomicroscopy for diagnosis of
Helicobacter pylori infection: a prospective study", Journal of gastroenterology and hepatology. 25(4), pp. 700-705.
30. Joo Mee (2017), "Rare Gastric Lesions Associated with Helicobacter pylori Infection: A Histopathological Review", Journal of pathology and translational medicine. 51(4), pp. 341-351.
31. Kim. Y. S et al. (2009), "A Case of H. pylori - associated Granulomatous Gastritis with Hypertrophic Gastropathy", Gut Liver. 3(2), pp. 137-40. 32. Konturek. JW (2003), "Discovery by Jaworski of Helicobacter pylori
and its pathogenetic role in peptic ulcer, gastritis and gastric cancer",
Journal of physiology and pharmacology. 54(S3), pp. 23-41.
33. Koyama. S and Nagashima. F (2003), "Idiopathic granulomatous gastritis with multiple aphthoid ulcers", Intern Med. 42(8), pp. 691-5. 34. Link Alexander et al. (2017), "Helicobacter pylori VacA genotype is a
predominant determinant of immune response to Helicobacter pylori CagA", World Journal of Gastroenterology. 23(26), pp. 4712-4723. 35. Marshall. Barry J and Warren. J Robin (1984), "Unidentified curved
bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration",
The Lancet. 323(8390), pp. 1311-1315.
36. Mishra Shrutkirti et al. (2008), "Detection of Helicobacter pylori in stool specimens: comparative evaluation of nested PCR and antigen detection". 2(03), pp. 206-210.
37. Nagase. L et al. (2015), "Dramatic increase in SHP2 binding activity of
Helicobacter pylori Western CagA by EPIYA-C duplication: its implications in gastric carcinogenesis", Sci Rep. 5, p. 15749.
38. Negash Markos et al. (2018), "Evaluation of SD BIOLINE H. pylori Ag rapid test against double ELISA with SD H. pylori Ag ELISA and EZ- STEP H. pylori Ag ELISA tests", BMC Clinical Pathology. 18, p. 4. 39. Nielsen. J. A et al. (2014), "Lymphocytic gastritis is not associated with
active Helicobacter pylori infection", Helicobacter. 19(5), pp. 349-55. 40. Nishikawa. H and Hatakeyama. M (2017), "Sequence Polymorphism and
Intrinsic Structural Disorder as Related to Pathobiological Performance of the Helicobacter pylori CagA Oncoprotein", Toxins (Basel). 9(4).
41. Nomura. A. M et al. (2002), "Helicobacter pylori CagA seropositivity and gastric carcinoma risk in a Japanese American population", J Infect Dis. 186(8), pp. 1138-44.
42. Oberhuber. G et al. (1998), "High proportion of granzyme B-positive (activated) intraepithelial and lamina propria lymphocytes in lymphocytic gastritis", Am J Surg Pathol. 22(4), pp. 450-8.
43. Oberhuber. G et al. (1996), "Evidence that intestinal intraepithelial lymphocytes are activated cytotoxic T cells in celiac disease but not in giardiasis", Am J Pathol. 148(5), pp. 1351-7.
44. Ohnishi. N et al. (2008), "Transgenic expression of Helicobacter pylori CagA induces gastrointestinal and hematopoietic neoplasms in mouse",
Proc Natl Acad Sci U S A. 105(3), pp. 1003-8.
45. Olbermann. P et al. (2010), "A global overview of the genetic and functional diversity in the Helicobacter pylori cag pathogenicity island",
PLoS Genet. 6(8), p. e1001069.
46. Pajares. Javier P. Gisbert and José María (2005), "Helicobacter pylori
Rescue Therapy After Failure of Two Eradication Treatments",
HELICOBACTER. 5(10), pp. 363-372.
47. Palli. D et al. (2007), "CagA+ Helicobacter pylori infection and gastric cancer risk in the EPIC-EURGAST study", Int J Cancer. 120(4), pp. 859-67.
48. Paniagua Gloria Luz et al. (2009), "Frequency of vacA, cagA and babA2 virulence markers in Helicobacter pylori strains isolated from Mexican patients with chronic gastritis". 8(1), p. 14.
49. Pellicano. R et al. (2005), "How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? An appraisal", Panminerva medica. 47(3), pp. 191-194.
50. Shiota. S, Suzuki. R, and Yamaoka. Y (2013), "The significance of virulence factors in Helicobacter pylori", J Dig Dis. 14(7), pp. 341-9. 51. Stein. S. C et al. (2017), "Helicobacter pylori modulates host cell
metabolite of LPS inner core heptose biosynthesis", PLoS Pathog. 13(7), p. e1006514.
52. Varbanova M and Malfertheiner P (2011), "Bacterial load and degree of gastric mucosal inflammation in Helicobacter pylori infection", Dig Dis. 29(6), pp. 592-599.
53. Viala. J et al. (2004), "Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the
Helicobacter pylori cag pathogenicity island", Nat Immunol. 5(11), pp. 1166-74.
54. Vilaichone. R. K et al. (2004), "Molecular epidemiology and outcome of
Helicobacter pylori infection in Thailand: a cultural cross roads",
Helicobacter. 9(5), pp. 453-9.
55. Wongphutorn Phattharaphon et al. (2018), "Detection and genotyping of Helicobacter pylori in saliva versus stool samples from asymptomatic individuals in Northeastern Thailand reveals intra-host tissue-specific H. pylori subtypes". 18(1), p. 10.
56. Yamane. T et al. (2010), "Isolated granulomatous gastritis showing discoloration of lesions after Helicobacter pylori eradication", Dig Endosc. 22(2), pp. 140-3.
57. Yee. J. K. C (2017), "Are the view of Helicobacter pylori colonized in the oral cavity an illusion?", Experimental & Molecular Medicine. 49(11), p. e397.