KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Xác định trình tự gene mã hóa kháng thể phage kháng Cyfra 21-
21-1
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH29 Hình 9: Hệ thống máy chạy Realtime_PCR
Thư viện phage của Griffin 1 chứa các đoạn kháng thể tổng hợp được tạo nên từ vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL). Chúng được liên
kết với nhau thông qua peptide liên kết để tạo thành chuỗi đơn (scFv). Các mảnh scFv này dung hợp với vỏ pIII của thực khuẩn thể M13 để tạo thành thư
viện các kháng thể bộc lộ trên phage.
Các vòng sàng lọc phage được tiến hành để thu nhận được kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Cyfra 21-1. Sàng lọc được tiến hành hơn 1 vòng để có thể làm giàu dòng phage mong muốn và loại bỏ được các dòng phage gắn không
đặc hiệu. Sàng lọc kháng thể phage kháng Cyfra 21-1 sử dụng kháng nguyên Cyfra 21-1 tránh được sự bắt cặp đa dạng so với sàng lọc sử dụng tế bào. Vì vậy, sau 3 vòng sàng lọc đã lựa chọn được dòng kháng thể phage kháng Cyfra
21-1 có ái lực cao.
Để khẳng định dòng phage chọn được có mang gene mã hóa cho kháng thể kháng Cyfra 21-1, chúng tôi tiến hành xác định trình tự đoạn gene mong
muốn.
Xác định trình tự gene mã hóa kháng thể
Dòng phage sau khi sàng lọc được xâm nhiễm vào E.coli chủng TG1 để làm giầu lên rồi tiến hành tách phagemid, tinh sạch và xác định trình tự. Trình tự
gene mã hóa kháng thể kháng Cyfra 21-1 được phân tích dựa trên các thông tin đã biết về phagemid vector. Bộ gene của phage thực chất là phagemid vector (pHEN2 vector) với vùng mã hóa kháng thể được gắn vào vị trí đa nối nằm trước
gene mã hóa protein vỏ pIII và nằm giữa cặp mồi LabF và LabR.
Theo đó, sau khi loại bỏ các đoạn trình tự mồi LabF, LabR, RBS, leader, vùng liên kết (linker), His-Tag,… được trình tự mã hóa đoạn kháng thể. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của kháng thể đặc hiệu Cyfra
21-1:
GGTGTCAGCGAACCCGGGAGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGCAGCAAC 60
G V S E P G R T V E I T C S G G G S S NTACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGGCACCTGGCAGTGCCCCTGTCAGTCTGATCTATGCT 120 TACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGGCACCTGGCAGTGCCCCTGTCAGTCTGATCTATGCT 120 Y Y G W Y Q Q K A P G S A P V S L I Y A AACACCAACAGACCCTCAAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCTGGATCCGGCTCCACA 180 N T N R P S N I P S R F S G S G S G S T AACACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGACGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGT 240 N T L T I T G V Q A D D E A V Y F C G S GGAGACGGCAGTTATTCTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCCGACCGTCCTAGGTCAG 300 G D G S Y S G I F G A G T T P T V L G Q TCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCAGA 360 S S R S S A V T L D E S G G G L Q T P R GGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGTGACCGTGGCATGTTC 420 G A L S L V C K A S G F T F S D R G M F TGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTTCGTCGCTGAAATTACCAAGGATGGT 480 W V R Q A P G K G L E F V A E I T K D G GGTGGCACATGGTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGG 540 G G T W Y G S A V K G R A T I S R D N G CAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCATCTACTGC 600 Q S T V R L Q L N N L R A E D T G I Y C TGCGCCAAACCTGCTGGTTATTGTTGGTATGGTGATTGTGGTGGTTGGATCGACGCATGG 660 C A K P A G Y C W Y G D C G G W I D A W GGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCAGGCCAGACCAGATCCTCAT 720 G H G T E V I V S S T S G Q A R P D P H
Hình 10: Kết quả trình tự gene mã hóa kháng thể kháng Cyfra 21-1
So sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene Quốc tế cho thấy trình tự nucleotide mã hóa cho kháng thể thu được trong nghiên cứu này có sự
tương đồng lên đến 99,7%.