Tình hình nghiên cứu polyphenol chè ở Việt Nam

3. Nội dung nghiên cứu

1.3.2 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè ở Việt Nam

Ở nước ta, do vị trí quan trọng của cây chè trong nền kinh tế quốc dân nên đã có nhiều nghiên cứu trên đối tượng này. Chỉ tính từ khoảng 10 năm trở lại đây đã có khoảng vài chục công trình được công bố song những nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào việc nghiên cứu quy trình, điều kiện trồng, chăm bón, chọn giống, chế biến, sinh trưởng phát triển và tăng năng suất của chè…Các nghiên cứu theo hướng hóa sinh học cũng chỉ tập trung vào các thành phần đóng vai trò chính trong việc nâng cao chất lượng chè uống. Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược học của các chất polyphenol khai thác từ chè Việt Nam với mục đích phục vụ lĩnh vực y dược còn rất ít; chỉ những năm gần đây mới xuất hiện một số công trình của trường Đại học Y Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ hóa sinh... Tuy nhiên, các nghiên cứu còn lẻ tẻ chưa có hệ thống. Từ năm 2002, Đỗ Thị Gấm đã tiến hành khảo sát các hợp chất polyphenol trong lá chè trồng ở vùng Tân Cương (Thái Nguyên) trên sản phẩm chè Trung Du cho biết các hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học cao trong lá chè chủ yếu là: Catechins và các dẫn xuất của catechins (catechin, epigallocatechin, gallocatechin, epigallocatechingallat,

glycozit, kaemferol-3-rhamnozyl, quercetagemin); theaflavin và diosmin [4]. Hàm lượng polyphenol trong lá chè Tân Cương biến động mạnh theo mùa và theo tuổi lá. Các nghiên cứu của Trần Thị Thanh Hương và đtg cho thấy: bột chiết polyphenol và EGCG chè xanh có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU -1 và dòng tế bào ung thư gan Hep - G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU - 1 với giá trị IC50 là 3, 84 µM của EGCG chè xanh. Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase - 3 trên dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG chè xanh vào môi trường nuôi cấy [13].

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Mẫu búp chè mẫu búp chè 1 tôm và 2 đến 3 lá non được thu thập từ một số giống chè trồng tại Thái Nguyên được Công ty chè Sông cầu, Huyện Đồng Hỷ, Tỉnh Thái Nguyên và TS. Dương Trung Dũng - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên chọn lọc và cung cấp (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các mẫu chè nghiên cứu

Kí hiệu Tên giống Địa điểm lấy mẫu

B Trung du xanh Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên C Trung du tím Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên D Indo Công ty chè Sông Cầu

E Keo am tích Công ty chè Sông Cầu F Bát tiên Công ty chè Sông Cầu G LDP1 Công ty chè Sông Cầu H pH1 Công ty chè Sông Cầu I Phúc vân tiên Công ty chè Sông Cầu

Mẫu búp chè được hái bằng tay, đảm bảo đúng kĩ thuật thu hái chè của vụ hè thu ( tháng 5 -10) nhằm làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm và tạo cho cây chè sinh trưởng khỏe, bền vững: năng suất búp chè có quan hệ chặt chẽ với số lá trên cây; với đặc điểm của cây chè mỗi một búp sinh ra từ 1 nách lá, do vậy nhiều lá mới có nhiều búp, năng suất cao; cho nên hái búp chè Thái Nguyên và chừa lá( nguyên tắc hái chừa hợp lý) có tương quan chặt đến năng suất chè[10].

2.1.2. Hóa chất, thiết bị

- Thiết bị và dụng cụ phân tích:

+ Máy LC/MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems, CA, USA.

+ Hệ thống HPLC Agilent 1260 Series, detetor DAD kết nối với khối phổ Agilent Single Quadrupole 6120 (Agilent, Santa Clara, USA).

+ Cột sắc ký: Cột Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ XDB C18 của hãng Agilent; cân điện tử (Max 220g, d = 10-4g), model: Practum 224-1S, Satorius, Germany.

+ Máy li tâm ống fancol, model: Centrifuge 5804R, Eppendorf, Germany.

+ Máy siêu âm (SH-100, Elma Schmidbauer GmbH, Đức). + Micropipet loại 100, 200, 1000 µL, Eppendorf, Germany. + Bình định mức loại 50 mL.

+ Xylanh nhựa 5 mL. + Máy real-time PCR. + Máy điện di.

+ Màng lọc 0,45 µm cho kim bơm mẫu dùng để lọc mẫu trước khi bơm vào hệ thốngvà các dụng cụ thí nghiệm khác.

+ Kit tách RNA thực vật (GeneJET Plant RNA Purification) của hãng Thermo Scientific.

+ Gen đích (target gene = Tg) và gen tham chiếu (reference gene = Ref); mồi Oligo(dT) và enzyme Reverse Transcriptase theo kit của hãng Affymetrix (First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real - Time PCR).

+ Gel agarose và các hóa chất khác.

- Chất chuẩn: 05 chất tham chiếu (C), (GC), (EGC), (EGCG), (ECG) trong 09 mẫu thử nghiệm

- Dung môi:

+ Acetonitril (ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Scharlau, Tây Ban Nha).

+ Nước đạt tiêu chuẩn HPLC (MilliQ Ultra Purification \system, Merck- Millipore, Đức).

2.2. Địa điểm và thời gian

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Viện nghiên cứu hệ gen và Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7/2017 đến tháng 12/2018.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu mẫu lá chè

Tám mẫu chè nghiên cứu ( Bảng 2.1) 1 tôm 2 đến ba lá đầu tiên được thu thập vào tháng 9 năm 2017. Mẫu chè được chia thành hai phần, một phần được sử dụng cho phân tích catechins được chiết trực tiếp với dung môi sau khi thu thập. Phần còn lại của mẫu được đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng để tách RNA nhằm mục đích định lượng sự biểu hiện của gen.

2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằngHPLC HPLC

2.3.2.1 Điều kiện sắc ký

Chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp. Pha động sử dụng hệ dung môi kênh A H2O (1% acetic) - kênh B ACN được thiết lập gradient biến thiên từ tỉ lệ 95/5 đến tỉ lệ 5/95 trong 45 phút; Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút; Lượng bơm mẫu: 5 µL; Thời gian phân tích: 45 phút; Nhiệt độ cột: 25 ; Bước sóng lựa chọn: 280 nm. Hệ thống LC/MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ làm khô đạt 250oC. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode negative với pic ion phân tử được lựa chọn như sau:

Bảng 2.2. Các chất chuẩn và pic ion nhận dạng

STT Chất tham chiếu Pic ion phân tử

1 C 325,0 [M+Cl]-

2 GC 341,0 [M+Cl]-

3 EGC 341,0 [M+Cl]-

4 EGCG 493,0 [M+Cl]-

5 ECG 477,0 [M+Cl]-

2.3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Cân chính xác 4mg (±0,1mg) chất chuẩn (C, GC, EGCG, EGC và ECG) vào bình định mức 5 mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 µg/mL. Dãy dung dịch chuẩn được khảo sát có nồng độ sau: 1, 5, 20, 50, 200, 500 µg/mL. Phân tích các chuẩn nói trên theo điều kiện sắc ký đã xây dựng, lặp lại 3 lần và xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak. Phương trình đường chuẩn được xây dựng trên phần mềm ChemStation, Agilent có dạng: y = ax + b với yêu cầu hệ số tương quan R2 > 0,99. Trong đó: y là diện tích peak thu được tương ứng với nồng độ chất chuẩn x (µg/mL).

- Định lượng C (1):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của C được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của C tại thời điểm 16,8 - 16,9 min với pic ion phân tử 325,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min.

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của GC được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 12,7 - 12,8 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của GC tại thời điểm 12,8 - 12,9 min với pic ion phân tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 12,7 - 12,8 min.

- Định lượng EGC (3):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGC được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 15,1 - 15,2 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của EGC tại thời điểm 15,2 - 15,3 min với pic ion phân tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 15,1 - 15,2 min.

- Định lượng EGCG (4): + Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGCG được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 18,8 - 18,9 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của EGCG tại thời điểm 18,9 - 19,0 min với pic ion phân tử 493,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 18,8 - 18,9 min.

- Định lượng ECG (5):

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của ECG được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 24,9 - 25,0 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của ECG tại thời điểm 25,0 - 25,1 min với pic ion phân tử 477,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 24,9 - 25,0 min.

2.3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Phương pháp xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đường nền. Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa chiều cao. LOD và LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (đối với LOD) và 10 lần (đối với LOQ).

2.3.2.4 Chuẩn bị mẫu

- Chuẩn bị chất tham chiếu: mẫu chất tham chiếu được pha trong dung môi MeOH thành nồng độ 2 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau để thiết lập đường chuẩn định lượng.

- Chuẩn bị mẫu phân tích: Cắt nhỏ mẫu, trộn đều và cân lấy 3g mẫu. Cho mẫu vào ống falcon 50ml sạch, khô, thêm 15mL MeOH, siêu âm 15 phút rồi ly tâm trong 5 phút, gạn lấy dịch chiết, lặp lại quy trình chiết 2 lần, gom dịch chiết vào bình định mức 50mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều.

- Các dung dịch chất tham chiếu và mẫu phân tích đều được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào hệ thống HPLC.

2.3.2.5 Phân tích HPLC

Mẫu nghiên cứu được lọc qua màng lọc 0,45 µm và phân tích bằng hệ thống LC Agilent Single Quadrupole 6120 (Agilent, Santa Clara, USA), cột sắc ký Zorbax SB-C18 (4,6x150mm, 5µm), cột bảo vệ SB-C18 Agilent 1260 (CA, USA).

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử

2.3.3.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè

RNA tổng số từ mẫu chè nghiên cứu được tách chiết theo quy trình kit tách RNA thực vật (GeneJET Plant RNA Purification) của hãng Thermo Scientific như sau:

Nghiền 2g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng. Bổ sung ngay lập tức 500µl Plat RNA Lysis Solution, sau đó chuyển sang ống eppendorf 1.5 ml. Ủ mẫu ở 56oC trong 5 phút, sau đó ly tâm 14.000 v/p trong 5 phút.

Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên và chuyển sang ống eppendorfd 1.5 ml mới, sau đó bổ sung 250µl ethanol 96%. Chuyển hỗn hợp thu được sang cột tinh sạch. Ly tâm cột ở 11.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

Bổ sung 700 µl Wash Buffer WB 1 vào cột tinh sạch. Ly tâm cột ở 11.000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl Wash Buffer 2 vào cột tinh sạch. Ly tâm trong 1 phút ở 11.000 v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Lặp lại bước 7 thêm lần nữa. Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 v/p, loại bỏ dịch chảy qua cột và chuyển cột sang ống Eppendorf 1.5 ml mới. Bổ sung 50µl nước không chứa Rnase vào giữa màng trong cột tinh sạch, ly tâm 11.000 v/p trong 1 phút.

Bỏ cột tinh sạch. Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260nm. RNA tổng số được bảo quản ở -80oC.

2.3.3.2 Phương pháp tổng hợp cDNA

Tổng hợp sợi cDNA đơn: Sợi cDNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA bằng kit tổng hợp cDNA USB® First - strand cDNA synthesis kit for Real-time PCR của hãng Affymetrix. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng ở bảng 2.3 và bảng 2.4. Các cDNA thu được được cất giữ ở tủ -20oC trước khi thực hiện các thí nghiệm sau đó.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích (µl) Primer oligodtT 2 Total RNA Ðến 1 µg 10X RT Buffer 2 10mM dNTPs 1 RNase Inhibitor 1 M-MLV RT 1 H2O Ðến 20µl

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA

Nhiệt độ Thời gian (phút)

Bước 1 44oC 60 Bước 2 92oC 10

2.3.3.3 Phương pháp định lượng sự biểu hiện của một số gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp polyphenol ở chè

Để so sánh mức độ biểu hiện của gen quan tâm trên các mẫu chè, chúng tôi sử dụng phương pháp real-time PCR định lượng tương đối theo phương pháp của Wang và đtg [39]. Các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm PCR được trình bày ở bảng 2.5:

Bảng 2.5.Danh sách và trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu định lượng sự biểu hiện của gen

Tên mồi Trình tự Gen đích Kích thước

sản phẩm

qCsGAPDH F TCAAGCAAGGACTGGAGAGG glyceraldehyde

-3-phosphate dehydrogenase

140bp

qCsGAPDH R ACAGTGGGAACGCGGAAAG

qCsANR F TCCGAGGATCCAGAGAATGAC Anthocyanidin

reductase 175bp

qCsANR R TCCAGTGACTCTCATCCATGAC

qCsLAR F ACTAGACCAACTCACCCTAGTCC Leucocyanidin

recductase 169bp

qCsLAR R CACCCCACACTCTTCTATCAATC

Thí nghiệm real-time PCR được thực hiện với gen đích (target gene = Tg) và gen tham chiếu (reference gene = Ref) ở các mẫu chè khác nhau. Khi đó, tương ứng với từng mẫu, sẽ có kết quả định lượng cho cả gen đích và gen tham chiếu với giá trị Ct khác nhau. Dựa trên các giá trị này, chu kì ngưỡng của gen đích trên các mẫu chè được tiêu chuẩn hóa bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu theo công thức

ΔCt = Ct(Tg) – Ct(Ref) (1)

Để so sánh tỷ lệ biểu hiện của một gen trên các mẫu thí nghiệm khác nhau, cần chọn một mẫu làm mẫu định chuẩn (calibrator=C). Ở đây, chúng tôi chọn mẫu chè Trung du xanh làm mẫu định chuẩn. Khi đó, mức độ biểu hiện của gen đích trên mẫu chè Trung du tím so với chè Trung du xanh được tính theo công thức:

R = 2-(ΔCt(chè Trung du tím) – ΔCt(chè Trung du xanh)) (2)

Dựa theo thiết kế thí nghiệm ở trên, chúng tôi sử dụng 5ng cDNA sợi đơn được tổng hợp từ RNA tổng số của mỗi mẫu chè để làm khuôn cho phản ứng real-time PCR. Phản ứng với mỗi gen ở từng mẫu chè được lặp lại ba