3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng
Millipore, Đức).
2.2. Địa điểm và thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Viện nghiên cứu hệ gen và Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7/2017 đến tháng 12/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu lá chè
Tám mẫu chè nghiên cứu ( Bảng 2.1) 1 tôm 2 đến ba lá đầu tiên được thu thập vào tháng 9 năm 2017. Mẫu chè được chia thành hai phần, một phần được sử dụng cho phân tích catechins được chiết trực tiếp với dung môi sau khi thu thập. Phần còn lại của mẫu được đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng để tách RNA nhằm mục đích định lượng sự biểu hiện của gen.
2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằngHPLC HPLC
2.3.2.1 Điều kiện sắc ký
Chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp. Pha động sử dụng hệ dung môi kênh A H2O (1% acetic) - kênh B ACN được thiết lập gradient biến thiên từ tỉ lệ 95/5 đến tỉ lệ 5/95 trong 45 phút; Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút; Lượng bơm mẫu: 5 µL; Thời gian phân tích: 45 phút; Nhiệt độ cột: 25 ; Bước sóng lựa chọn: 280 nm. Hệ thống LC/MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ làm khô đạt 250oC. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode negative với pic ion phân tử được lựa chọn như sau:
Bảng 2.2. Các chất chuẩn và pic ion nhận dạng
STT Chất tham chiếu Pic ion phân tử
1 C 325,0 [M+Cl]-
2 GC 341,0 [M+Cl]-
3 EGC 341,0 [M+Cl]-
4 EGCG 493,0 [M+Cl]-
5 ECG 477,0 [M+Cl]-
2.3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Cân chính xác 4mg (±0,1mg) chất chuẩn (C, GC, EGCG, EGC và ECG) vào bình định mức 5 mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 µg/mL. Dãy dung dịch chuẩn được khảo sát có nồng độ sau: 1, 5, 20, 50, 200, 500 µg/mL. Phân tích các chuẩn nói trên theo điều kiện sắc ký đã xây dựng, lặp lại 3 lần và xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak. Phương trình đường chuẩn được xây dựng trên phần mềm ChemStation, Agilent có dạng: y = ax + b với yêu cầu hệ số tương quan R2 > 0,99. Trong đó: y là diện tích peak thu được tương ứng với nồng độ chất chuẩn x (µg/mL).
- Định lượng C (1):
+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm
+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của C được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của C tại thời điểm 16,8 - 16,9 min với pic ion phân tử 325,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min.
+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm
+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của GC được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 12,7 - 12,8 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của GC tại thời điểm 12,8 - 12,9 min với pic ion phân tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 12,7 - 12,8 min.
- Định lượng EGC (3):
+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm
+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGC được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 15,1 - 15,2 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của EGC tại thời điểm 15,2 - 15,3 min với pic ion phân tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 15,1 - 15,2 min.
- Định lượng EGCG (4): + Bước sóng lựa chọn: 280 nm
+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGCG được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 18,8 - 18,9 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của EGCG tại thời điểm 18,9 - 19,0 min với pic ion phân tử 493,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 18,8 - 18,9 min.
- Định lượng ECG (5):
+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của ECG được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 24,9 - 25,0 min đối với các mẫu chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của ECG tại thời điểm 25,0 - 25,1 min với pic ion phân tử 477,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 24,9 - 25,0 min.
2.3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Phương pháp xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đường nền. Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa chiều cao. LOD và LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (đối với LOD) và 10 lần (đối với LOQ).
2.3.2.4 Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị chất tham chiếu: mẫu chất tham chiếu được pha trong dung môi MeOH thành nồng độ 2 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau để thiết lập đường chuẩn định lượng.
- Chuẩn bị mẫu phân tích: Cắt nhỏ mẫu, trộn đều và cân lấy 3g mẫu. Cho mẫu vào ống falcon 50ml sạch, khô, thêm 15mL MeOH, siêu âm 15 phút rồi ly tâm trong 5 phút, gạn lấy dịch chiết, lặp lại quy trình chiết 2 lần, gom dịch chiết vào bình định mức 50mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều.
- Các dung dịch chất tham chiếu và mẫu phân tích đều được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào hệ thống HPLC.
2.3.2.5 Phân tích HPLC
Mẫu nghiên cứu được lọc qua màng lọc 0,45 µm và phân tích bằng hệ thống LC Agilent Single Quadrupole 6120 (Agilent, Santa Clara, USA), cột sắc ký Zorbax SB-C18 (4,6x150mm, 5µm), cột bảo vệ SB-C18 Agilent 1260 (CA, USA).