3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Định lượng sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
polyphenol ở chè
Phương pháp real-time PCR định lượng là một công cụ quan trọng để định lượng sự biểu hiện sản phẩm phiên mã của gen nhanh chóng và tin cậy nhờ vào tính đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. Tuy nhiên, một
phân tích real-time PCR thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tính toàn vẹn của RNA tổng số, hiệu suất của phản ứng phiên mã ngược, thiết kế mồi, lựa chọn phương pháp hiển thị hóa học và phân tích số liệu. Bởi vì các biến trong thí nghiệm là không thể tránh khỏi, điều này yêu cầu cần có phương pháp chính xác để tiêu chuẩn hóa (normalization) trong phân tích real-time PCR định lượng. Trong đó, tiêu chuẩn hóa với một gen tham chiếu (reference gene) có biểu hiện ổn định là một phương pháp đơn giản và khá thông dụng. Trong 8 giống chè được chúng tôi định lượng, giống chè Trung du từ lâu đã được coi là khởi thủy của cây chè Việt Nam, có khả năng chịu bệnh, chịu hạn, sinh trưởng mạnh, giá trị kinh tế cao, bảo vệ môi trường sinh thái. Vì vậy chúng tôi chọn chè Trung du xanh và Trung du tím để định lượng real- time PCR. Trong thí nghiệm định lượng sự biểu hiện của gen
LAR và ANR ở 2 mẫu chè nghiên cứu, chúng tôi sử dụng gen GADPH mã hóa cho enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase làm gen tham chiếu. Gen GADPH là gen quản gia (houseskeeping gene), đã được chứng minh là có sự biểu hiện ổn định ở các mô khác nhau và ở các điều kiện khác nhau. Trên thực tế, gen GADPH đã được sử dụng làm gen tham chiếu trong phân tích real time PCR trong nghiên cứu của Wang và đtg (2012) [40].
Kết quả khuếch đại qua mỗi chu kì của các gen GADPH, LAR và ANR ở mỗi mẫu chè được thể hiện ở hình 3.3 .
A
Hình 3.3. Đồ thị khuếch đại của các gen trong phản ứng real-time.
A: Đồ thị khuếch đại của gen GADPH, gen ANR trong một lần chạy 1
B: Đồ thị khuếch đại của gen GADPH và gen LAR trong một lần chạy 2. Như được đề cập ở trên, lợi thế của real-time PCR so với phương pháp PCR truyền thống là kết quả khuếch đại DNA ở mỗi chu kì được ghi lại thông qua cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được ở mỗi ống phản ứng. Sự thay đổi cường độ tín hiệu này được ghi lại trên một đồ thị biểu diễn, gọi là đường cong khuếch đại. Ở đó, trục hoành biểu diễn các chu kì, và trục tung thể hiện cường độ huỳnh quang của các chu kì đó.Có thể nhận thấy, đồ thị khuếch đại của các gen đều có hình dạng đặc trưng với lí thuyết. Ban đầu, khi lượng sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng còn thấp, tín hiệu thu được là dạng đường thẳng, có giá trị gần bằng 0. Đến một chu kì nhất định, tín hiệu huỳnh quang bắt đầu tăng lên theo mức lũy thừa, đường biểu diễn đi lên theo đường chéo. Sau đó, khi lượng sản phẩm PCR đạt đến mức độ bão hòa, đường biểu diễn chuyển sang thành đường ngang. Đồng thời, chúng tôi thực hiện phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR trong ống phản ứng. Đầu tiên, nhiệt độ được đẩy lên cao, 950C trong 1 phút để biến tính hoàn toàn sản phẩm có trong ống phản ứng. Tiếp theo, nhiệt độ hạ xuống 550C để các sản phẩm khuếch đại có thể bắt cặp lại với nhau để hình thành mạch DNA đôi. Sau đó, nhiệt độ được đưa lên từ từ với mỗi bước tăng là 0.20C trong 1 giây. Ở mỗi bước này, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận và ghi lại. Bởi vì SYBR Green chỉ bám vào DNA mạch đôi và phát ánh sáng, DNA mạch đơn không được SYBR gắn vào, tín hiệu ghi nhận được sẽ giảm dần tương ứng với sự giảm dần số lượng của phân tử DNA mạch đôi trong hỗn hợp. Khi đến bước tăng nhiệt độ mà ở đó trùng khớp với Tm của sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng, cường độ huỳnh quang sẽ giảm đột ngột vì có đến 50% sản phẩm khuếch đại bị biến tính thành sợi đơn cùng một lúc. Nhờ đó, Tm của sản phẩm khuếch đại có trong ống được xác định. Do đó, thông qua phân tích nhiệt độ
nóng chảy của phản ứng PCR, có thể biết được sản phẩm khuếch đại có đặc hiệu hay có hiện tượng dư thừa dimer hay không (Hình 3.4).
A
Hình 3.4.Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại trong các ống phản ứng
A: Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại gen GADPH, gen
ANR trong một lần chạy 1
B: Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại gen GADPH và gen LAR trong một lần chạy 2
Ở đây, trục hoành là dải nhiệt độ, và trục tung là sự biến thiên của cường độ tín hiệu huỳnh quang. Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm khuếch đại của các gen khá đặc hiệu, thể hiện là một đỉnh rõ ràng trên đồ thị. Tm của các sản phẩm khuếch đại gen GADPH là 83,7; gen ANR là 81,5 và gen LAR là 84
Từ mỗi biểu đồ khuếch đại của gen, một đường tín hiệu ngưỡng cắt các đường cong khuếch đại của gen tại các vị trí xác định. Giá trị hoành độ của các điểm trên là giá trị chu kì ngưỡng Ct của ống phản ứng. Chúng tôi thu được kết quả giá trị Ct của các gen quan tâm và gen tham chiếu trên hai mẫu chè như bảng 3.3 (giá trị của 3 lần lặp lại được tính trung bình).
Bảng 3.3. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 1 (Thông số của các gen trong mỗi lần chạy được ghi riêng trong từng bảng nhỏ)
Mẫu Giá trị Ct của
gen GADPH
Giá trị Ct của gen ANR Chè Trung du xanh 17,34 ± 0,064 17,84 ± 0,017
Chè Trung du tím 18,73 ± 0,04 20,16 ± 0,065
Bảng 3.4. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 2 (Thông số của các gen trong mỗi lần chạy được ghi riêng trong từng bảng nhỏ)
Mẫu Gía trị Ct của
gen GADPH
Gía trị Ct của gen LAR
Chè Trung du xanh 17,22 ± 0,032 17,13 ± 0,020
Chè Trung du tím 18,5 ± 0,049 19,72 ± 0,032
Sử dụng công thức (1), chúng tôi tiêu chuẩn hóa giá trị ΔCt của các gen quan tâm dựa trên gen tham chiếu (gen GADPH). Kết quả được thể hiện trên bảng 3.5 .
Bảng 3.5. Giá trị ΔCt của các gen ở hai mẫu chè.
Mẫu
Giá trị ΔCt của gen ANR
Giá trị ΔCt của gen LAR Chè Trung du xanh 0.5 ± 0.081 -0.09 ± 0.052 Chè Trung du tím 1.43 ± 0.105 1.22 ± 0.081 R 0.525 0.403
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chè Trung du xanh làm mẫu định chuẩn. Khi đó, coi mức độ biểu hiện các gen quan tâm ở chè Trung du xanh là 1, mức độ biểu hiện của các gen tương ứng trên chè Trung du tím được tính toán theo công thức (2). Kết quả tính toán cho thấy các gen ANR, LAR có mức độ biểu hiện ở cây chè Trung du tím bằng 0.525, 0.403 so với mức độ biểu hiện của các gen này ở cây chè Trung du xanh.
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen LAR, ANR trong hai mẫu chè Trung du tím và chè Trung du xanh. CT: chè Trung du tím, CX: chè
Trung du xanh
Từ hình 3.5 là biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen quan tâm ở hai mẫu chè. Có thể nhận thấy rõ rằng, cả hai gen đều biểu hiện cao hơn ở cây chè Trung du xanh. Như vậy, mức độ phiên mã của cả hai gen ở Trung du xanh đều cao hơn so với Trung du tím. Biểu hiện của LAR trong Trung du xanh cao gấp 2,3 lần so với Trung du tím. Trong khi đó, so với Trung du xanh, Trung du tím thể hiện mức độ biểu hiện ANR thấp hơn khoảng 2 lần.
3.3. Mối liên quan giữa hàm lượng catechins với sự biểu hiện của các gen
LAR và ANR ở chè Trung du xanh và chè Trung du tím
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã định lượng hàm lượng của catechins trong hai giống chè địa phương của Việt Nam là Trung du xanh và Trung du tím. Trung du xanh thuộc giống chè có lá màu xanh lá, trong khi chè tím Trung du tím có nụ và lá màu tím. Mẫu ngay sau khi thu, catechins được được chiết xuất với 100% methanol. Cấu trúc bình thường của catechins được chứng minh là không ổn định ở nhiệt độ trên 80°C (Chen và đtg, 1995) [21]. Vì vậy, phương pháp chiết xuất có kiểm soát nhiệt độ đã được áp dụng.
C, GC, EGC, EGCG và ECG là các hợp chất được phát hiện trong hai giống chè nghiên cứu. Hàm lượng riêng của từng catechins trong hai giống
chè được trình bày trong bảng 3.2. Các catechins được xác định định lượng bằng phân tích HPLC. Trong các catechins được nghiên cứu, GC có nồng độ cao nhất trong cả hai mẫu chiết xuất chè. Trong khi đó hàm lượng C cho thấy mức thấp nhất trong cả hai giống. Hàm lượng của EGC, EGCG và ECG trong Trung du xanh đều cao hơn so với Trung du tím.
Catechins có nguồn gốc từ nhiều nhánh của con đường chuyển hóa flavonoid. Catechins được chuyển hóa từ leucocyanidin và leucoanthocyanidin do xúc tác LAR và ANR. Sinh tổng hợp epicatechin và epigallocatechin trước hết là nhờ anthocyanidin synthase- ANS để chuyển leucoanthocyanidin thành anthocyanidin. Sau đó, anthocyanidin có thể được chuyển đổi thành epicatechin bằng ANR hoặc dẫn xuất các dẫn xuất nhờ enzyme UFGT (Liu và đtg, 2005) [32].
Hàm lượng catechins khác nhau tùy thuộc vào giống chè, thời gian thu thập, giai đoạn phát triển, phương pháp chế biến. Tổng hàm lượng catechins của giống Longjing43 là gần 150 mg/g trong búp chè khô với khoảng 5 mg/g EGC, 13 mg/g C, 52 mg/g EGCG, 65 mg/g ECG (Zhang và đtg, 2016) [46]. So sánh, tỷ lệ giữa các hợp chất catechins trong chè Trung du tím và Trung du xanh không phù hợp với Zhang. Những lý do có thể là sự khác biệt về giống, thu thập thời gian, quy trình xử lý để phân tích HPLC. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết luận của Djemukhatze K.M. (1981) khi nghiên cứu về các cây chè dại ở Việt Nam (rừng chè dại ở Suối Giàng, Tiên Thông và Thông Nguyên) cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là: (-)- epicatechin và (-) - epicatechin gallat (chiếm 70% tổng số các loại catechins). Khi di thực cây chè dại này lên phía Bắc, với các điều kiện khắc nghiệt hơn về khí hậu, chúng sẽ thích ứng dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechins phức tạp hơn, cùng với sự tạo thành (-) epigallocatechin và các gallat của chúng [1].
Giả thuyết này được hỗ trợ bởi phân tích PCR về các gen có liên quan đến tổng hợp catechins. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen ANR và LAR trong hai giống chè, kết quả này hoàn toàn phù hợp với mức độ biểu hiện tương đối của hai gen LAR, ANR trong hai mẫu chè Trung du tím và chè Trung du xanh. Trung du xanh cho thấy các biểu hiện cao hơn của gen LAR và ANR so với Trung du tím, điều này có thể giải thích tại sao hàm lượng catechins trong Trung du xanh cao hơn so với Trung du tím trong phân tích HPLC.
Như vậy, nghiên cứu này của chúng tôi đã chứng minh rằng giống Trung du xanh chứa hàm lượng catechins cao hơn Trung du tím. Các kết quả phân tích định lượng sự biểu hiện ở mức độ phiên mã bằng real time PCR phù hợp với giả thuyết này vì cả gen LAR và ANR trong lá chè Trung du tím thể hiện yếu hơn nhiều so với chè Trung du xanh. Catechins có rất nhiều lợi ích cho sức khỏe. Do đó, những phát hiện của chúng tôi sẽ góp phần tăng cường hoạt động bảo tồn và phát triển các giống chè địa phương.
KẾT LUẬN
1. Từ phương pháp HPLC, chúng tôi đã định lượng thành công năm thành phần catechin chính trong tám mẫu chè khác nhau trồng tại Thái Nguyên. Kết quả cho thấy mẫu chè Indo có hàm lượng catechin tổng và catechin thành phần vượt trội, các mẫu chè Keo am tích, Phúc vân tiên, Bát tiên và Trung du xanhcó hàm lượng tương đương nhau. Mẫu chè pH1 có hàm lượng catechin tổng thấp nhất.
2. Sử dụng phương pháp real-time PCR định lượng sự biểu hiện của gen
LAR và ANR trong hai mẫu chè Trung du xanh và Trung du tím. Ở cả hai giống chè đều có sự biểu hiện của hai gen LAR và ANR, tuy nhiên mức độ biểu hiện của hai gen này ở chè Trung du xanh cao hơn chè Trung du tím.
3. Thiết lập được mối liên quan giữa hàm lượng catechins và sự biểu hiện của gen LAR và ANR ở chè Trung du xanh và chè Trung du tím. Chè Trung du xanh cho thấy gen LAR và ANR biểu hiện cao hơn so với chè Trung du tím, điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả định lượng hàm lượng catechins.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu định lượng sự biểu hiện của các gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp catechins ở các giống chè địa phương khác và nghiên cứu vào các thời điểm khác nhau trong năm nhằm góp phần làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp catechins và định hướng phát triển các sản phẩm chè.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1] Djemukhatze K.M. (1981),“Cây chè Miền Bắc Việt Nam”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[2] Đỗ Ngọc Qũy & Lê Thất Khương (2000) “Giáo trình cây chè sản xuất chế biến và tiêu thụ”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[3] Đỗ Ngọc Quỹ (1991) “Sự thành lập và hoạt động của trạm nghiên cứu nông nghiệp Phú Hộ 1918- 1945”, Viện nghiên cứu chè.
[4] Đỗ Thị Gấm (2002) “ Đánh giá sự biến động thành phần polyphenol trong lá chè Tân cương (Thái nguyên) và hoạt tính chống oxy hóa của chúng”, Hội nghị Hóa sinh y dược.
[5] Đỗ Tất Lợi (2000) “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB KH & KT, Hà nội.
[6] Giang Trung Khoa, Nguyễn Thanh Hải, Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Bích Thủy, Phạm Đức Nghĩa, Nguyễn Thị Oanh, Phan Thu Hương, P.Duez (2013) “Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến thành phần hóa học cơ bản của giống chè trung du”, Tạp chí khoa học và phát triển, 11(3), 373-279.
[7] Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Văn Tuấn & Hoàng Thị Ngà (2012) “Nghiên cứu đa dạng di truyền genome một số dòng chè (Camellia sinensis) trồng tại xã Tân Cương – Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ thuật RAPD”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, 96(8), tr. 139 -143.
[8] Hoàng Thị Thu Yến, Dương Thị Nhung, La Quang Thương & Hà Thị Loan (2014) “Nghiên cứu chỉ thị SSR ở một số giống/dòng chè trồng tại Thái Nguyên”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, 120(6), tr. 13-19.
[9] Lê Tất Khương & Hoàng Văn Chung (1999) “Giáo trình cây chè”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[10] Lương Văn Vượng, Phạm Huy Thông, Lê Văn Đức & Lê Hồng Vân (2013) “Kỹ thuật sản xuất và chế biến chè xanh”, NXB Nông nghiệp, 47, Hà Nội.
[11] Mai Tuyên, Vũ Bích Lan, Ngô Quang Đại (2008) Bài báo khoa học “Nghiên cứu chiết xuất và xác định tác dụng kháng oxy hóa của polyphenol từ lá chè xanh Việt nam”.
[12] Nguyễn Minh Hùng & Đinh Thị Phòng (2004) “Đánh giá tính đa hình RAPD genome một số giống chè”. Tạp chí công nghệ sinh học, 2(1), tr. 109-116.
[13] Trần Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2006) “Bước đầu nghiên cứu tác dụng của polyphenol chè xanh (Camellia sinensis) trên một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy”, Tạp chí Nghiên cứu Y học - ĐHYHN, Vol.41, N02;
[14] Trịnh Xuân Ngọ( 2009) “Cây chè và kĩ thuật chế biến chè”, NXB Khoa Học Kĩ Thuật Công Nghệ .
[15] Vũ Thi Thư, Đoàn Hùng Tiến và đtg (2001) “Các hợp chất hóa học có trong chè và một số phương pháp phân tích thông dụng trong sản xuất chè ở Việt Nam ”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
[16] Viện nghiên cứu Chè (1994) “Kết quả nghiên cứu khoa học và triển khai công nghệ về Chè (1989 - 1993)”
Tài liệu tiếng nước ngoài
[17] Bandyopadhyay D., Chatterjee T.K., Dasgupta A., Lourduraja J., Dastidar S.G. (2005) “In vitro and in vivo antimicrobial action of tea: the commonest beverage of Asia”,Biol Pharm Bull 28 2125-2127. [18] Bursill C., Roach P.D., Bottema C.D., Pal S. (2001) “Green tea
regulated element binding Protein in HepG2 liver cells”, J Agric Food Chem 49 5639-5645.
[19] Byung Zun Ahn. (1995) “Proceeding of UNESCO regione seminar on the chemistry, pharmacology and clinical use of Flavonoit compounds; Polyoxyfenate Flavones, synthesis, cytotoxicities and Autitumor activity against ICR Maice carrying S-180 cell”, Korea Oct. 11-85, pp 107 – 113.
[20] Chen, C. W and Ho, C. T. (1995) “Antioxidant properties of polyphenols extracted from green tea and black tea”, J. Food Lip. 2, pp 35 – 46. [21] Chi, Tang Ho, Tea and Tea Products (2008) “Chemistry and Health”,
Promoting Propertiess.
[22] Harbowy M. E. & Balentine D. A. (1997) “Tea chemistry”. Critical Reviews ill Plant Sciences, 16(5), pp. 415-480.
[23] Harborn J. B (1964) “Biochermistry of phenolic compounds”, Academic press, London and New york.
[24] Harborn J. B (1986) Nature, distribution and function of plant flavonoids, in “Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical,