Đánh giá các thông số đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu Song nàng nghiên cứu: Tần số alen, số alen trung bình (NA) cho mỗi locus, hệ số gen dị hợp tử quan sát (HO), hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng (HE), hệ số tƣơng đ ng và hệ số khoảng cách di truyền giữa các quần thể, và mức độ khác nhau giữa các quần thể (FST) đƣợc thực hiện bằng phần mềm GenAIEx (Peakall và Smouse, 2006) [29].
Việc kiểm định giả thiết sự cho các lô cút đa hình và giữa các quần thể đƣợc thực hiện ở mức ý nghĩa p=0,05 và ph n tích AMOVA (variance components in the analysis of molecular variance) nhằm xác định sự khác biệt di truyền giữa các quần thể nghiên cứu đƣợc ph n tích trên phần mềm Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005) [31].
Ph n tích UPGMA trên cơ sở khoảng cách di truyền dùng POPTREE2 (Takezaki et al., 2010).
Để đánh giá các thông số đa dạng di truyền và thụ phấn chéo của Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới núi thấp Mã Đà, hạt của 9 c y trội đƣợc chọn, thu thập và gieo ƣơm tại Vƣờn ƣơm Biên Hòa (Trung t m L m nghiệp Biên Hòa, Đ ng Nai), và đƣợc đánh số từ SN01 đến SN09. C y trội đƣợc chọn ngẫu nhiên theo khoảng cách địa lý và tiêu chí đặc điểm hình thái (Quyết định của Bộ L m nghiệp ban hành Quy phạm kỹ thuật x y dựng rừng giống và vƣờn giống (QPN 15-93)). Hạt từ các c y trội đƣợc thu thập vào tháng 5 và 6. Sau 2 hoặc 3 tháng nẩy mầm, lá c y con đƣợc sử dụng để ph n tích tính đa dạng di truyền và thụ phấn chéo ở c y trội. Phần mềm MLTR (Ritland, 2002) đƣợc sử dụng để xác định các thông số về thụ phấn, bao g m hệ số thụ phấn chéo đa locus (tm), hệ số thụ phấn chéo một locus (ts),hệ số tự thụ phấn (s), hệ số tƣơng quan hai thế hệ (rp), và hệ số thụ phấn cận noãn (F).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR-SSR
Tách chiết DNA là bƣớc đầu tiên và rất quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử nói chung. Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc tế bào. Điều quan tâm là thu nhận đƣợc DNA ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy, không lẫn nhiều tạp chất để có ngu n nguyên liệu chất lƣợng tốt cho các thí nghiệm tiếp theo. Các mẫu vỏ các cây Dầu song nàng đƣợc tách.
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số từ vỏ cây một số mẫu Dầu song nàng thu ở Đông Nam Bộ trên gel agarose 1%
Chiết theo phƣơng pháp CTAB các bƣớc tiến hành nhƣ mục 2.2.1 chƣơng 2. DNA tổng số của 73 mẫu vỏ thân c y trƣởng thành thuộc 3 quần thể Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) ở rừng nhiệt đới núi thấp Đông Nam Bộ (Bảng 2.1) đã đƣợc tách chiết thành công với chất lƣợng DNA cao.
Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% cho thấy DNA tổng số thu đƣợc khá tốt, DNA không bị gãy. DNA tổng số của một số mẫu đƣợc trình bày ở Hình 3.1. Kết quả đo OD cho chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết cao). Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể và loài của 73 cá thể thu đƣợc từ 3 quần thể loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) chúng tôi tiến hành nghiên cứu với 9 cặp m i SSR (Bảng 2.2). Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, sản phẩm đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6% để ph n tích đa hình DNA của các mẫu nghiên cứu.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6%
với Dipt01(trên), Dipt04 (dƣới)
Mẫu nghiên cứu. Hình ảnh các băng vạch xuất hiện trên bản điện di sau đó đƣợc chụp lại trên máy soi gel của hãng CLEARVER. Mã hoá các phổ điện di cho mỗi bản gel đƣợc tiến hành cẩn thận và thí nghiệm đƣợc lặp lại cho đến khi đạt đƣợc kết quả. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% của một số cá thể thu đƣợc từ 3 quần thể loài Dầu song nàng ở Đông Nam Bộ với một số cặp m i SSR đƣợc trình bày ở Hình 3.2.
3.2. Đánh giá hiệu quả chỉ thị marker SSR
Với 9 cặp m i microsatellite, đã xác định 35 allele khác nhau, với kích thƣớc dao động từ 114bp đến 286bp. Chín locus nghiên cứu đều cho kết quả đa hình với loài Dầu song nàng nghiên cứu. Số allele trung bình 4,4 cho một locus, dao động từ 3 ở locus Dipt1 đến 5 ở 4 locus Dipt2, Dipt4, Dipt7 và Dipt8. Các giá trị PIC, PD và RP đã đƣợc xác định cho 9 locus đa hình (Bảng 3.1). Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) phản ánh khả năng cho đa hình của các cặp m i SSR. Hệ số PIC của cặp m i nào cao thì khả năng cho đa hình càng cao trong ph n tích đa dạng di truyền của các đối tƣợng nghiên cứu và ngƣợc lại.
Giá trị PIC đƣợc tính toán cho tất cả các cặp m i SSR đa hình. Giá trị PIC cao nhất (0,745) đƣợc tìm thấy ở cặp m i Dipt7 và thấp nhất (0,219) ở cặp m i Dipt1; giá trị PIC trung bình là 0,491. Giá trị PD giao động từ 0,256 ở cặp m i Dipt1 đến 0,837 ở cặp m i Dipt2, trung bình đạt 0,629. Giá trị PD cao > 0,8 đƣợc tìm thấy cho cặp m i Dipt2 và Dipt7 và thấp nhất cho cặp m i Dipt01. Tƣơng tự, giá trị RP dao động từ 2,244 (Dipt1) đến 3,168 (Dipt4) và 2,849 (Dipt2), trung bình đạt 2,614.
Kết quả các giá trị này của loài Dầu song nàng là cao so với các giá trị này (PIC=0,324) của loài Thông Xuân Nha (Pinusarmandii subsp.
xuannhaensis) ở Khu Bảo t n Thiên nhiên Xuân Nha (Tam et al., 2015). Các giá trị thu đƣợc đã phản ánh các cặp m i SSR nghiên cứu đã cung cấp những thông tin có giá trị về đặc điểm loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới núi thấp Mã Đà (Khu bảo t n thiên nhiên và văn hóa Đ ng Nai, Vĩnh Cửu, Đ ng Nai).
Bảng 3.1. Số allele và các giá trị PIC, PD, Rp và MI cho 9 locus đa hình
Locus Trình tự nucleotide mỗi cặp mồi SSR
Nhiệt độ bắt cặp Số allele Kích thƣớc allele PIC PD Rp Dipt2 [26] F:AGTTTTATACATCACCGCCAA R: GAAGCCCCTAAGAATTAACCTGA 56oC 5 114- 142 0,665 0,837 2,849 Dipt7 [26] F: CAGGAGGGGAATATGGAAAA R:AAGTCGTCATCTTTGGATTGC 54oC 5 120- 150 0,745 0,815 2,826 Shc2 [15] F: CACGCTTTCCCAATCTG R: TCAAGAGCAGAATCCAG 55oC 4 258- 286 0,616 0,789 2,276 Dipt8 [26] F: ATGCTTACCACCAATGTGAATG R: CTCGCAGCAGAACAACTTTCTA 55oC 4 170- 270 0,445 0,628 2,633 Dipt1 [28] F: CTTCCCTAAATTCCCCAATGTT R:TAATGGTGTGTGTACCAGGCAT 55oC 3 193- 211 0,219 0,256 2,244 Dipt4 [26] F: TAGGGCATATTGCTTTCTCATC R: CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA 55oC 3 214- 256 0,448 0,570 3,168 Dipt6 [26] F: TGGCAAACAAGCTACTGTTCAT R: CATGGGTTTAGCAACCTACACA 56oC 3 258- 286 0,569 0,673 2,269 Dipt3 [26] F:ACAATGAAACTTGACCACCCAT R:CAAAAGGACATACCAGCCTAGC 56oC 4 224- 256 0,244 0,457 2,648 Shc7 [41]
F: ATGTC CATGT TTGAG TG R: CATGG ACATA AGTGG AG
55oC 4 170- 230
0,468 0,642 2,611
Chú thích: PIC: chỉ số đa hình, PD: chỉ số sai khác giữa các cặp cá thể, Rp: chỉ số sai khác của mỗi cặp m i.
3.3. Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng bằng chỉ thị phân tử SSR
3.2.1. Tần số allele trong quần thể
Số allele trong một locus bao g m từ 3 allele ở 3 locus Dipt1, Dipt4 vàDipt6; 4 allele ở 3 locus Dipt3, Shc2, Dipt8 và Shc7; và 5 allele ở 2 locus còn lại, Dipt2 và Dipt7. Từ bảng 3.2 chỉ ra sự khác biệt giữa các allele trong mỗi locus tại những quần thể khác nhau.
Ở locus Dipt2 thì ở cả 2 quần thể Mã Đà và Lò Gò Xa Mát allele chiếm tỉ lệ cao đều là allele130 với tỉ lệ ở quần thể Mã Đà là 50% và Lò Gò – Xa Mát là 52% trong khi đó allele chiếm tỉ lệ cao ở quần thể T n Phú lại là
allele114 với tỉ lệ 37%. Nếu ở Dipt2 các allele chiếm tỉ lệ cao khác nhau giữa các allele thì allele chiếm tỉ lệ thấp ở cả 3 quần thể đều là allele142 với tỉ lệ lần lƣợt của các quần thể Mã Đà, Lò Gò – Xa Mát, Tân Phú là 4,8%, 4% và 5,6%; và allele136 với tỉ lệ lần lƣợt của 3 quần thể này là 9,5%, 4% và 7,4%. Allele có tần số thấp cũng đƣợc tìm thấy ở allele128 của quần thể Mã Đà là 9,5%.
Locus Dipt7 tần số các allele giữa các quần thể lại có sự khác biệt rõ ràng. Ở quần thể Mã Đà 2 allele chiếm tỉ lệ cao nhất là allele125 và allele127 cùng với tỉ lệ 28,6%; quần thể Lò Gò – Xa Mát allele chiếm tỉ lệ cao là allele125 (48%) nhƣng không có sự xuất hiện của allele150; allele120 chiếm 61.1% là tỉ lệ cao nhất ở quần thể T n Phú. Xuất hiện allele hiếm (<5%) ở 2 quần thể Mã Đà và T n Phú là allele150 với tỉ lệ lần lƣợt là 4,8% và 3,7%. 2 allele có tần số thấp cũng xuất hiện ở allele127 và allele138 tƣơng ứng 7,4% và 5,6%. Locus Dipt7 ở quần thể Lò Gò – Xa Mát chỉ xuất hiện 4 allele.
Allele138 của locus Shc2 là allele xuất hiện nhiều nhất ở 2 quần thể Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát với tần xuất lần lƣợt là 54,8% và 44% trong khi đó với tần xuất 44,4% allele129 là allele xuất hiện nhiều nhất ở quần thể T n Phú. Nếu allele xuất hiện nhiều nhất ở Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát là giống nhau thì allele xuất hiện tần số thấp nhất lại là allele144 ở 2 quần thể Mã Đà và T n Phú với phần trăm là 7,1% và 7,4%; quần thể Lò Gò – Xa Mát với tần xuất 12% thuộc allele129 ít thấy nhất ở locus Shc2. Tần số thấp cũng tìm thấy ở allele129 của quần thể Mã Đà, với tỉ lệ 9,5%.
Chiếm hơn 50% tổng allele ở locus Dipt8 ở quần thể Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát là allele175 với phần trăm là 66,7% và 70%. Trong khi đó chỉ chiếm 48,1% ở allele170 vẫn là allele xuất hiện nhiều nhất ở locus Dipt8 ở quần thể T n Phú. Với tần xuất thấp lần lƣợt là 4,8% và 7,4% đƣợc tìm thấy tƣơng ứng ở allele270 ở quần thể Mã Đà và T n Phú. Tần số thấp cũng tìm thấy ở allele200 thuộc quần thể T n Phú, chiếm 8%. 4/5 allele
đƣợc tìm thấy ở quần thể Lò Gò – Xa Mát, thấp hơn 1 allele ở 2 quần thể còn lại Mã Đà và Tân Phú.
Dipt1 là locus chỉ có 3 allele và allele có tần số lớn nhất đều là allele193 ở cả 3 quần thể, đặc biệt là quần thể Lò Gò – Xa Mát allele này chiếm đến 90% tổng số allele. Allele chiếm tỉ lệ ít nhất ở locus này chỉ giống nhau ở quần thể Mã Đà và Tân Phú; với tỉ lệ 9,5% và 7,4% của allele270; ở quần thể Lò Gò – Xa Mát xuất hiện 2 allele có tần số thấp là allele200 và allele211 ứng với tỉ lệ 2% và 8%.
Dipt4 là locus mà cả 3 quần thể Mã Đà, Lò Gò – Xa Mát và Tân Phú, allele có tần số lớn nhất và nhỏ nhất đều thuộc allele214 (>50%) và allele250 (8%-13%).
Dipt3 g m 4 allele224, allele229, allele240 và allele256. Allele 256 không xuát hiện ở quần thể Lò Gò – Xa Mát; trong đó allele224 là allele có tần số lớn nhất ở cả 3 quần thể, Mã Đà, Lò Gò – Xa Mát và Tân Phú vớiphần trăm lần lƣợt là 59,5%, 86% và 40,7%. Trong khi đó allele240 là allele có tần số nhỏ nhất ở quần thể Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát (4,8% và 6%) và allele256 là allele có tần số nhỏ nhất ở trong quần thể T n Phú, chiếm 9,3%.
Shc7 cũng g m 4 allele và 1 allele170 không xuất hiện ở quần thể Lò Gò – Xa Mát. Trong đó quần thể Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát tiếp tục có allele tần số lớn nhất giống nhau là allele224 còn ở quần thể T n Phú là allele170. Nếu allele224 là allele có tần số lớn nhất ở Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát thì ở quần thể T n Phú đ y là allele có tần số nhỏ nhất chỉ chiếm 5,6%. Ở quần thể Mã Đà và Lò Gò – Xa Mát thì allele có tần số nhỏ nhất tiếp tục giống nhau là allele184 với phần trăm lần lƣợt là 9,5% và 4%.
Dipt6 chỉ có 3 allele, trong đó allele 286 là allele xuất hiện ít nhất ở cả 3 quần thể Mã Đà, Lò Gò – Xa Mát và T n Phú với tần số là 14,3%, 14% và 20,4%. Nhƣng ở allele xuất hiện nhiều nhất lại khác nhau, ở quần thể Mã Đà là allele258 với tần xuất 50%, ở quần thể Lò Gò – Xa Mát và T n Phú là allele264 với tần
xuất lần lƣợt là 44% và 55,6%.
Bảng 3.2. Tần số allele cho mỗi locus của 3 quần thể ở Đông Nam Bộ
Locus Allele Mã Đà Lò Gò-Xa Mát Tân Phú
Dipt2 21 25 27 114 0.262 0.300 0.370 128 0.095 0.100 0.278 130 0.500 0.520 0.222 136 0.095 0.040 0.074 142 0.048 0.040 0.056 Dipt7 21 25 27 120 0.262 0.100 0.611 125 0.286 0.480 0.222 127 0.286 0.240 0.074 138 0.119 0.180 0.056 150 0.048 0.000 0.037 Shc2 21 25 27 124 0.286 0.220 0.370 129 0.095 0.120 0.444 138 0.548 0.440 0.111 144 0.071 0.220 0.074 Dipt8 21 25 27 170 0.167 0.220 0.481 175 0.667 0.700 0.352 200 0.119 0.080 0.074 270 0.048 0.000 0.093 Dipt1 21 25 27 193 0.548 0.900 0.593 200 0.357 0.020 0.333 211 0.095 0.080 0.074 Dipt4 21 25 27 214 0.619 0.540 0.519 230 0.286 0.380 0.352 250 0.095 0.080 0.130 Dipt3 21 25 27 224 0.595 0.860 0.407 229 0.238 0.080 0.389 240 0.048 0.060 0.111 256 0.119 0.000 0.093 Shc7 21 25 27 170 0.190 0.000 0.463 178 0.333 0.380 0.333 184 0.095 0.040 0.148 224 0.381 0.580 0.056 Dipt6 21 25 27 258 0.500 0.420 0.241 264 0.357 0.440 0.556 286 0.143 0.140 0.204
3.2.2. Đa dạng di truyền loài Dầu song nàng
Với 9 cặp m i microsatellite đã khám phá ra 35 allele khác nhau. Tỉ lệ phần trăm locus đa hình cho loài Dầu song nàng ở cả 3 địa điểm nghiên cứu, rừng phòng hộ Tân Phú, Khu Bảo t n Thiên nhiên Mã Đã và Vƣờn Quốc gia Lò Gò – Xa Mát là 100. Tất cả 9 locus đa hình đều đƣợc tìm thấy ở cả quần thể nghiên cứu. Tuy nhiên, số allele cho mỗi locus đa hình là khác nhau ở mỗi locus cho mỗi quần thể. Trong đó, 3 allele đƣợc tìm thấy ở 3 locus, Dipt6, Dipt4 và Dipt1 cho 3 quần thể; Dipt8 ở Lò Gò – Xa Mát, và 2 locus ở quần thể Lò Gò – Xa Mát. 4 allele đƣợc tìm thấy ở locus Shc2 cho cả 3 quần thể, 2 locus Dipt8 và Dipt3 cho 2 quần thể Mã Đà và T n Phú, và locus Dipt7 ở quần thể Lò Gò – Xa Mát. 5 allele đƣợc ghi nhận cho locus Dipt2 ở cả 3 quần thể, và Dipt7 ở 2 quần thể Mã Đà và T n Phú.
Allele hiếm (rare allele) đƣợc định nghĩa dựa trên tần số xuất hiện của chúng. Kimura (1983) [30] đã định nghĩa allele hiếm là allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn q với q = 0,01. Đối với số lƣợng mẫu lên đến 100 thì một allele sẽ đƣợc xem là hiếm nếu nó xuất hiện không quá hai lần và số lần xuất hiện của một allele hiếm sẽ là không quá 200 lần khi lƣợng mẫu đạt tới 10.000. Nhƣng theo Pervaiz et al. (2009) [35], allen hiếm là allele xuất hiện với tần số ≤ 0,05 trong tổng số mẫu nghiên cứu. Allele hiếm (tần số allele dƣới 10%) cũng đƣợc tìm thấy ở 5 locus, bao g m Dipt2, Dipt1, Dipt3, Dipt8 và Shc7 cho cả 3 quần thể Mã Đà, Lò Gò – Xa Mát và T n Phú. Trong khi đó, allele hiếm đƣợc tìm thấy ở 2 locus, bao g m Shc2 và Dipt7 cho 2 quần thể Mã Đà và Tân Phú; và 1 locus Dipt4 cho 2 quần thể mã Đà và Lò Gò – Xa Mát. Không tìm thấy allele hiếm ở 2 locus Dipt7 và Shc2 cho quần thể Lò Gò – Xa Mát; locus Dipt4 ở Tân Phú; và locus Dipt6 ở cả 3 quần thể nghiên cứu. Tƣơng tự, 1 allele hiếm đƣợc tìm thấy ở locus Dipt7 cho quần thể Mã Đà,
Dipt1 và Dipt3 ở 2 quần thể Mã Đà và T n Phú, và Shc7 ở cả 3 quần thể nghiên cứu. 2 allele hiếm đƣợc xác định ở locus Dipt2 cho quần thể Lò Gò – Xa Mát, Shc2 ở Mã Đà, Dipt8 ở Tân Phú, và Dipt1, Dipt3 ở Lò Gò – Xa Mát. Và 3 allele hiếm chỉ tìm thấy ở locus Dipt7 thuộc quần thể Tân Phú. Không tìm thấy allele hiếm ở locus Dipt6 cho cả 3 quần thể. Ngoài ra, không tìm thấy allele hiếm ở một số locus, nhƣ Dipt7, Shc2 ở Lò Gò – Xa Mát, và Dipt4 ở Tân Phú.
Locus đa hình với tần số alen phổ biến > 70% chỉ đƣợc tìm thấy ở 3 locus Dipt8, Dipt3 và Dipt1 cho quần thể Lò Gò – Xa Mát.