Kỹ thuật định type HLA độ phân giải cao cho 1 Locus (A, B,

Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4. 2 Phương pháp xử lý số liệu

2.4.3. Kỹ thuật định type HLA độ phân giải cao cho 1 Locus (A, B,

* Chuẩn bị bệnh nhân - mẫu bệnh phẩm: Mẫu máu toàn phần thể tích 2ml, được chống đông với EDTA, ghi rõ họ tên và năm sinh của bệnh nhân.

* Vật tư - trang thiết bị

 Hệ thống máy Luminex 3D

* Hóa chất:

 Kit tách chiết DNA

 Kit PCR SSO (gồm 4 locus A, B, DR, DQ)

 Tag polymerase

 SAPE (R-Phycoerythrin-Conjugated Streptavidin)

 Sheath fluid

 Bleach 20%

* Nguyên lý: Đoạn DNA đích được khuếch đại nhờ nhóm primer chuyên biệt thông qua quá trình PCR. Sau đó sản phẩm PCR bị biến tính và lai. Quá trình này giúp cho các probes tương ứng trên các beads (đã mã hóa) có khả năng gắn kết DNA tương thích. Sau cùng SAPE được thêm vào giúp phát hiện khả năng phát huỳnh quang của mỗi bead. Dựa vào hình thái phản ứng của bead phần mềm sẽ so sánh, phân tích và đưa ra kết quả cho kiểu gen HLA.

* Phương pháp: Luminex, phân tích dòng chảy. QUY TRÌNH:

- Tách triết DNA

+ Tách theo quy trình của nhà xản xuất

+ Đo nồng độ DNA thu được ở 2 bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA lý tưởng thu được là 20ng/ml (tỷ lệ A260/A280nm là 1,65 – 1,80).

+ Lưu trữ DNA ở nhiệt độ - 20oC. - Khuếch đại

+ Chuẩn bị

 Bật máy chu kì nhiệt.

 Rã đông và vortex D-mix và DNA.

 Hoá chất (trừ SAPE) để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

 Rã đông tất cả hoá chất cần thiết cho quá trình khuếch đại (DNA mẫu, D-mix, primer) và giữ trên dụng cụ giữ lạnh.

 Chuẩn bị hỗn hợp 4l primer, 13,8 µl D-mix và 0,4l I-taq (hỗn hợp chuẩn bị cho 1 mẫu). Trộn đều và ly tâm nhanh.

 Nhỏ 18,2µl hỗn hợp đã chuẩn bị ở bước 3 vào giếng có chứa DNA

 Đậy nắp cho plate PCR.

 Đặt plate vào máy chu kì nhiệt và chạy theo chương trình của LABType - SSO PCR:

+ Chu trình nhiệt

Các bước Nhiệt độ và thời gian ủ Chu kỳ

Bước 1 96oC - 03:00 1 Bước 2 96oC - 00:20 5 60oC - 00:20 72oC - 00:20 Bước 3 96oC - 00:10 30 60oC - 00:15 72oC - 00:20 Bước 4 72oC - 10:00 1 Bước 5 4oC 1

Khi chương trình kết thúc, kiểm tra sản phẩm với phương pháp điện di trên gel.

- Biến tính - Trung hòa

+ Bật máy chu kì nhiệt ở chế độ ủ 60oC.

+ Sử dụng một plate PCR sạch, nhỏ 2,5µl dung dịch Denaturation vào các giếng.

+ Phân phối 5µl sản phẩm PCR thu được vào plate PCR sạch trên. + Trộn đều cho đến khi màu đổi sang hồng nhạt.

+ Chuẩn bị hỗn hợp Hybridization Mix cho 4 locus HLA-A, HLA-B,

HLA-DR, HLA-DQ. Nhỏ 34 µl dung dịch Hybridization, 4 µl Bead Mix vào 4 tube sạch (thể tích hỗn hợp tương đương với 1 mẫu), trộn đều và chắn sáng.

+ Kết thúc quá trình ủ, nhỏ 5µl dung dịch Neutralization vào các giếng. + Trộn đều đến khi đổi sang màu vàng chanh.

+ Nhỏ 38µl dung dịch Hybridization Mix ở bước D6 vào plate PCR. Đậy kín plate và trộn đều.

+ Đặt plate vào máy chu kì nhiệt, ủ 60oC trong 15 phút.

+ Lấy plate ra, nhỏ 100 µl Wash Buffer vào, đậy kín, ly tâm 3000 vòng trong 5 phút.

+ Loại bỏ lượng dung dịch thừa ở trên, để lại khoảng 10µl trong giếng. + Lặp lại bước rửa 3 lần.

+ Trong lần rửa cuối, chuẩn bị hỗn hợp SAPE 1X (0,5µl SAPE stock và 49,5µl SAPE Buffer, thể tích hỗn hợp cho 1 mẫu), để nhiệt độ phòng và chắn sáng.

- Đánh dấu

+ Sau lần rửa cuối, nhỏ 50µl hỗn hợp SAPE 1X đã chuẩn bị ở trên vào các giếng.

+ Đậy kín plate và trộn đều.

+ Ủ 60oC trong 5 phút ở máy chu kì nhiệt.

+ Kết thúc quá trình ủ, nhỏ 100µl Wash Buffer vào các giếng. Đậy kín và ly tâm 3000 vòng trong 5 phút.

+ Loại bỏ dung dịch phía trên và nhỏ thêm Wash Buffer vào để thể tích còn lại trong giếng là 80µl.

+ Trộn đều và nhỏ toàn bộ mẫu sang plate, đọc kết quả.