3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, quyết định tới sự thành công cho các bước thí nghiệm tiếp theo. Để tách chiết DNA một cách hiệu quả cần lựa chọn một phương pháp phù hợp với đối tượng nghiên cứu. DNA tổng số từ mẫu lá được tách chiết dựa theo phương pháp CTAB của Doyle [22] có cải biến theo quy trình dưới đây:
Bước 3 Bổ sung 800µl đệm CTAB, đảo đều
Bước 4 Ủ ở 65
ra đảo bằng tay 1 lần
Bước 5 Bổ sung 700µl 24:1 (chloroform : isoamyl), lắc ở nhiệt độ phòng
trong 20 phút
Bước 6 Ly tâm 13000 vòng trên phút trong 10 phút
Bước 7 Hút dịch bề mặt bằng pipette sang ống eppendorf 1,5 ml
Bước 8 Bổ sung 600µl isopropanol và đảo nhẹ ống
Bước 9 Ủ ở -20
Bước Ly tâm 13000 vòng trên phút trong 15 phút
10
Bước Loại bỏ isopropanol và thêm 1ml cồn 70%, ly tâm 13000 vòng
11 trên phút trong 5 phút
Bước Loại bỏ dịch thừa, để ống eppendorf chứa DNA ở nhiệt độ phòng
12 cho đến khi dung dịch thừa bay hơi hoàn toàn
Bước Bổ sung 100µl TE
13
Bước Bảo quản ở -20
14
2.5.2. Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA
DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng máy đo quang phổ hấp phụ NanodropOne. Các bước tiến hành như sau:
- Sử dụng giấy thấm lau sạch 2 đầu của máy đo, sử dụng pipette hút 2µl dung dịch DNA cần đo nhỏ lên dụng cụ đo để đo nồng độ và ghi lại giá trị đã đo được.
- Sau mỗi lần đo cần sử dụng giấy thấm vệ sinh máy đo.
• Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Từ các mẫu DNA đã tách được, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để tiến hành khuếch đại số lượng DNA. Tiến hành nhân 3 đoạn gen ITS1, matK và rbcL từ DNA tổng số đã tách chiết bằng phản ứng PCR với các cặp mồi:
ITS1-L1F và ITS1-R: matK-1F và matK-1R; rbcL-1F và rbcL-1R. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR sử dụng INtRON PCR master mix
Hoá chất
INtRON PCR master mix Primer F
Primer R DNA
Nước cất khử ion
Tổng thể tích
Các thành phần sau khi được trộn đều trong ống eppendorf 20µl và đưa vào máy spindown khoảng 3 giây sau đó đưa vào máy PCR chạy với chu trình nhiệt như sau:
94oC
2:00
0:30
∞
Hình 2.1 Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại DNA
Sau khi chạy xong phản ứng PCR, kiểm tra sản phẩm bằng cách chạy điện di trên gel Agarose.
2.5.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose theo các bước sau:
- Đun gel agarose 1%, để cho gel nguội đến khoảng 50-60oC.
- Bổ sung 3µl Ethidium Bromide.
- Lắc đều, đổ gel vào khuôn có cài sẵn răng lược cho đến khi gel đông lại.
- Trộn đều mẫu cần điện di với đệm tra mẫu (loading dye) với tỷ lệ mẫu và đệm là 10µl:2µl.
sẽ kéo phân tử acid nucleic lắng xuống đáy giếng, sau đó đặt bản gel vào bể điện di đã được đổ đầy bởi dung dịch TAE 1X (ngập bản gel).
- Tiến hành chạy điện di ở 100V. Quan sát khi mẫu chạy được 2/3 bản gel (khoảng 25 phút) thì tắt máy, nhấc bản gel ra và đặt vào máy soi gel để quan sát các băng DNA và chụp ảnh.
2.5.4. Phương pháp phân tích trình tự gen và mối quan hệ di truyền
Sản phẩm PCR vùng gen kiểm tra được giải trình tự bởi 1st BASE tại Singapore.
Kết quả giải trình tự được xử lý thô để loại bỏ các vùng có tín hiệu nhiễu, không rõ ràng nhằm chỉnh sửa các vị trí lỗi do giải trình tự. Trình tự sau khi được xử lí sẽ được sử dụng để so sánh với các trình tự tương ứng đã được công bố và các loài có trên GenBank. Việc phân tích trình tự được hỗ trợ bởi các phần mềm như SnapGene Viewer 5.2.4; BioEdit 7.2. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng cách sử dụng phần mềm MEGA X theo phương pháp Maximum – Likelihood với giá trị bootstrap là 1000.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá hình thái
Kết quả đánh giá một số đặc điểm hình thái các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được tóm tắt ở bảng dưới đây:
Bảng 3.1 So sánh một số đặc điểm hình thái giữa các mẫu lan Kim Tuyến
Mẫu Hình d HG1 Lá hình trứng HG2 Lá hình trứng HG3 Lá hình trứng HG4 Lá hình trứng BK Lá hình trứng LS Lá hình trứng LC Lá hình trứng TN Lá hình trứng
Phân tích các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được cho thấy có sự đa dạng về hình thái giữa các cá thể chủ yếu ở đặc điểm các bộ phận như màu sắc lá, màu sắc thân, màu sắc gân lá, cụ thể như sau:
Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu vàng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu trắng xanh, hơi ngả hồng ở gần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
Hình 3.1 Hình ảnh mẫu HG1
- HG2: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá và cuống lá có màu hồng nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, phần gần các đốt, gốc cây sẫm màu hơn và hơi ngả hồng.
- HG3: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu xanh nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
Hình 3.3 Hình ảnh mẫu HG3
- HG4: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
- BK: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, những đường gân phụ trên lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn.
Hình 3.5 Hình ảnh mẫu BK
- LS: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở phần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn.
- LC: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu trắng hồng nhạt, phần cuống lá có màu xanh nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt.
Hình 3.7 Hình ảnh mẫu LC
- TN: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, những đường gân phụ của lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở gần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, sẫm màu hơn ở phần gốc.
Hình 3.9 Hình ảnh 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được
a: mẫu HG1; b: mẫu HG2; c: mẫu HG3; d: mẫu HG4
Hình 3.10 Hình ảnh mặt trước và sau lá của các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được
a: mẫu HG1; b: mẫu HG2; c: mẫu HG3; d: mẫu HG4 ; e: mẫu BK;
f: mẫu LS; g: mẫu TN; h: mẫu LC
3.2. Kết quả tách chiết DNABảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA Mẫu HG1 HG2 HG3 HG4 BK LS LC TN
Từ bảng 3.2 ta có thể thấy:
- Sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu lá lan Kim Tuyến gần như đều có tỉ số OD260/280 trong khoảng từ 1,8 - 2,0 (là khoảng cho phép thể hiện mức độ đạt tiêu chuẩn không chứa tạp chất và protein).
- Sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu HG1, HG3, HG4, BK, LC có nồng độ DNA từ khoảng 30 – 80 ng/µl, sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu HG2, LS, TN có nồng độ DNA từ khoảng 190 – 230 ng/µl.
- Kết quả cho thấy mẫu DNA đảm bảo điều kiện để thực hiện các phản ứng PCR.
3.3. Kết quả khuếch đại DNA và giải trình tự
3.3.1. Kết quả khuếch đại vùng gen ITS1 và giải trình tự
- Kết quả khuếch đại vùng gen ITS1:
Hình 3.11 Kết quả PCR khuếch đại gen ITS1
Để khuếch đại vùng gen ITS1, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi ITS1F và ITS1R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra đều
cho một băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 400 bp tương ứng với kích thước lý thuyết. Điều này chứng tỏ sản phẩm khuếch đại gen bằng cặp mồi ITS1F/ITS1R khá đặc hiệu (hình 3.11).
- Kết quả giải trình tự vùng gen ITS1:
Để xác đinh trình tự vùng gen ITS1, sản phẩm PCR được khuếch đại
(hình 3.11) được tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự gen
ITS1 của các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên NCBI (phụ lục
1) và tỉ lệ Nucleotide của các mẫu nghiên cứu vùng gen ITS1 được trình bầy
ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen ITS1
Mẫu HG1 HG2 HG3 HG4 BK LS LC TN
Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng trình tự ITS1của 8 mẫu lan Kim Tuyến trong nghiên cứu cho thấy 8 mẫu lan Kim Tuyến đã được giải trình tự vùng ITS1 với tổng chiều dài thu được là từ 384 đến 387 nucleotide, chi tiết có thể xem được ở bảng 3.3. Bên cạnh đó kết quả so sánh trình tự các mẫu nghiên cứu với các mẫu tham chiếu còn chỉ ra ngoài 2 vùng đầu bị nhiễu và sai khác khá nhiều, thì mẫu HG4 còn có sự sai khác ở trình tự thứ 124 so với các mẫu tham chiếu, mẫu HG2, HG3 có sự sai khác ở vị trí thứ 288 so với các mẫu tham chiếu.
kết quả sắp hàng trình tự cho thấy các loài khác lan Kim Tuyến khác nhau đều có trình tự vùngITS1 khá tương đồng, chỉ sai khác từ 1 đến 2 nucleotide hoặc
giống nhau hoàn toàn, có thể nhận thấy vùng gen ITS1 khá bảo thủ và có thể
giúp nhận dạng các loài thuộc chi lan Kim Tuyến nhưng khó có thể nhận biết các đơn vị loài hoặc dưới loài một cách hoàn hảo.
Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS1 của các mẫu nghiên cứu
Kết quả lập cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen ITS1 cho thấy 8 mẫu lan trong nghiên cứu có quan hệ không quá gần gũi
với các loài nào trong các loài tham chiếu có sẵn trên GenBank. Mẫu LS có quan hệ gần gũi với mẫu TN với giá trị bootstrap là 96, mẫu HG2 có quan hệ gần gũi với mẫu HG4 với giá trị bootstrap là 59, mẫu BK có quan hệ gần gũi với mẫu LC với giá trị bootstrap là 71, mẫu HG1 có quan hệ gần gũi với mẫu HG3 với giá trị bootstrap là 81.
Hình 3.13 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen ITS1 giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu
Bên cạnh đó bảng hệ số khác biệt di truyền hình 3.13 còn chỉ ra sự khác biệt giữa trình tự các mẫu nghiên cứu với các trình tự tham chiếu có sẵn trên GenBank, với độ tương đồng từ 94,3% cho đến cao nhất là 96,2%.
3.3.2. Kết quả khuếch đại vùng gen matK và giải trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen matK: trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen matK:
Để khuếch đại vùng gen matK, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi matK-1F
và matK-1R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra
đều cho một băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 820 bp tương ứng với kích thước lý thuyết. Điều này chứng tỏ sản phẩm khuếch đại gen bằng cặp mồi matK-1F/matK-1R khá đặc hiệu (hình 3.15).
- Kết quả giải trình tự vùng gen matK:
Để xác đinh trình tự vùng gen matK, sản phẩm PCR được khuếch đại
(hình 3.15) được tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự gen
matK của các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên NCBI (phụ lục
2)và tỉ lệ Nucleotide của các mẫu nghiên cứu vùng gen matK được trình bầy
ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen matK
Tổng số Mẫu Nucle- otide HG1 825 HG2 829 HG3 850 HG4 813 BK 827 LS 821 LC 816 TN 848
có thể xem được ở bảng 3.4. Bên cạnh đó kết quả so sánh trình tự các mẫu nghiên cứu với các mẫu tham chiếu còn chỉ ra các mẫu nghiên cứu đều có khá nhiều điểm sai khác so với các mẫu tham chiếu. Kết quả BLAST các mẫu nghiên cứu với các trình tự có sẵn trên GenBank có mức độ tương đồng với một số trình tự tham chiếu lên tới 98%.
Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen matK của các mẫu nghiên cứu
Kết quả lập cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen matK cho thấy 8 mẫu lan trong nghiên cứu đều bắt nguồn từ một nhánh trên cây phát sinh, trong đó có cả một loài trong các trình tự tham chiếu là
HG1 có quan hệ gần gũi với mẫu BK với giá trị bootstrap là 96, mẫu HG4 có quan hệ gần gũi với mẫu TN với chỉ số bootstrap là 15. Giá trị bootstrap cho thấy độ tin cậy khá thấp đối với cây phân loại.
Hình 3.17 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen matK giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu
Dựa vào bảng hệ số khác biệt di truyền, có thể thấy các mẫu nghiên cứu