3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.5.4. Phương pháp phân tích trình tự gen và mối quan hệ di truyền
Sản phẩm PCR vùng gen kiểm tra được giải trình tự bởi 1st BASE tại Singapore.
Kết quả giải trình tự được xử lý thô để loại bỏ các vùng có tín hiệu nhiễu, không rõ ràng nhằm chỉnh sửa các vị trí lỗi do giải trình tự. Trình tự sau khi được xử lí sẽ được sử dụng để so sánh với các trình tự tương ứng đã được công bố và các loài có trên GenBank. Việc phân tích trình tự được hỗ trợ bởi các phần mềm như SnapGene Viewer 5.2.4; BioEdit 7.2. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng cách sử dụng phần mềm MEGA X theo phương pháp Maximum – Likelihood với giá trị bootstrap là 1000.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá hình thái
Kết quả đánh giá một số đặc điểm hình thái các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được tóm tắt ở bảng dưới đây:
Bảng 3.1 So sánh một số đặc điểm hình thái giữa các mẫu lan Kim Tuyến
Mẫu Hình d HG1 Lá hình trứng HG2 Lá hình trứng HG3 Lá hình trứng HG4 Lá hình trứng BK Lá hình trứng LS Lá hình trứng LC Lá hình trứng TN Lá hình trứng
Phân tích các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được cho thấy có sự đa dạng về hình thái giữa các cá thể chủ yếu ở đặc điểm các bộ phận như màu sắc lá, màu sắc thân, màu sắc gân lá, cụ thể như sau:
Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu vàng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu trắng xanh, hơi ngả hồng ở gần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
Hình 3.1 Hình ảnh mẫu HG1
- HG2: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá và cuống lá có màu hồng nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, phần gần các đốt, gốc cây sẫm màu hơn và hơi ngả hồng.
- HG3: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu xanh nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
Hình 3.3 Hình ảnh mẫu HG3
- HG4: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn và nhạt dần về phía ngọn.
- BK: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu tím hồng, những đường gân phụ trên lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng nhạt, cuống lá có màu xanh. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn.
Hình 3.5 Hình ảnh mẫu BK
- LS: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở phần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh đậm, ở phần gốc và phần thân già có màu sẫm hơn.
- LC: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh, mặt dưới lá có màu xanh nhạt, gân lá có màu bạc, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu trắng hồng nhạt, phần cuống lá có màu xanh nhạt. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt.
Hình 3.7 Hình ảnh mẫu LC
- TN: Lá hình trứng, to, tròn ở phía cuống lá và nhọn dần về phía đầu. Mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới lá có màu xanh tím, những đường gân phụ của lá mọc dày, gân lá có màu hồng, có ánh kim, bề mặt lá có một lớp lông mềm. Phần bẹ lá có màu hồng, ngả xanh ở gần cuống lá. Thân cây mọng nước có màu xanh nhạt, sẫm màu hơn ở phần gốc.
Hình 3.9 Hình ảnh 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được
a: mẫu HG1; b: mẫu HG2; c: mẫu HG3; d: mẫu HG4
Hình 3.10 Hình ảnh mặt trước và sau lá của các mẫu lan Kim Tuyến thu thập được
a: mẫu HG1; b: mẫu HG2; c: mẫu HG3; d: mẫu HG4 ; e: mẫu BK;
f: mẫu LS; g: mẫu TN; h: mẫu LC
3.2. Kết quả tách chiết DNABảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA Mẫu HG1 HG2 HG3 HG4 BK LS LC TN
Từ bảng 3.2 ta có thể thấy:
- Sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu lá lan Kim Tuyến gần như đều có tỉ số OD260/280 trong khoảng từ 1,8 - 2,0 (là khoảng cho phép thể hiện mức độ đạt tiêu chuẩn không chứa tạp chất và protein).
- Sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu HG1, HG3, HG4, BK, LC có nồng độ DNA từ khoảng 30 – 80 ng/µl, sản phẩm DNA được tách chiết từ các mẫu HG2, LS, TN có nồng độ DNA từ khoảng 190 – 230 ng/µl.
- Kết quả cho thấy mẫu DNA đảm bảo điều kiện để thực hiện các phản ứng PCR.
3.3. Kết quả khuếch đại DNA và giải trình tự
3.3.1. Kết quả khuếch đại vùng gen ITS1 và giải trình tự
- Kết quả khuếch đại vùng gen ITS1:
Hình 3.11 Kết quả PCR khuếch đại gen ITS1
Để khuếch đại vùng gen ITS1, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi ITS1F và ITS1R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra đều
cho một băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 400 bp tương ứng với kích thước lý thuyết. Điều này chứng tỏ sản phẩm khuếch đại gen bằng cặp mồi ITS1F/ITS1R khá đặc hiệu (hình 3.11).
- Kết quả giải trình tự vùng gen ITS1:
Để xác đinh trình tự vùng gen ITS1, sản phẩm PCR được khuếch đại
(hình 3.11) được tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự gen
ITS1 của các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên NCBI (phụ lục
1) và tỉ lệ Nucleotide của các mẫu nghiên cứu vùng gen ITS1 được trình bầy
ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen ITS1
Mẫu HG1 HG2 HG3 HG4 BK LS LC TN
Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng trình tự ITS1của 8 mẫu lan Kim Tuyến trong nghiên cứu cho thấy 8 mẫu lan Kim Tuyến đã được giải trình tự vùng ITS1 với tổng chiều dài thu được là từ 384 đến 387 nucleotide, chi tiết có thể xem được ở bảng 3.3. Bên cạnh đó kết quả so sánh trình tự các mẫu nghiên cứu với các mẫu tham chiếu còn chỉ ra ngoài 2 vùng đầu bị nhiễu và sai khác khá nhiều, thì mẫu HG4 còn có sự sai khác ở trình tự thứ 124 so với các mẫu tham chiếu, mẫu HG2, HG3 có sự sai khác ở vị trí thứ 288 so với các mẫu tham chiếu.
kết quả sắp hàng trình tự cho thấy các loài khác lan Kim Tuyến khác nhau đều có trình tự vùngITS1 khá tương đồng, chỉ sai khác từ 1 đến 2 nucleotide hoặc
giống nhau hoàn toàn, có thể nhận thấy vùng gen ITS1 khá bảo thủ và có thể
giúp nhận dạng các loài thuộc chi lan Kim Tuyến nhưng khó có thể nhận biết các đơn vị loài hoặc dưới loài một cách hoàn hảo.
Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS1 của các mẫu nghiên cứu
Kết quả lập cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen ITS1 cho thấy 8 mẫu lan trong nghiên cứu có quan hệ không quá gần gũi
với các loài nào trong các loài tham chiếu có sẵn trên GenBank. Mẫu LS có quan hệ gần gũi với mẫu TN với giá trị bootstrap là 96, mẫu HG2 có quan hệ gần gũi với mẫu HG4 với giá trị bootstrap là 59, mẫu BK có quan hệ gần gũi với mẫu LC với giá trị bootstrap là 71, mẫu HG1 có quan hệ gần gũi với mẫu HG3 với giá trị bootstrap là 81.
Hình 3.13 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen ITS1 giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu
Bên cạnh đó bảng hệ số khác biệt di truyền hình 3.13 còn chỉ ra sự khác biệt giữa trình tự các mẫu nghiên cứu với các trình tự tham chiếu có sẵn trên GenBank, với độ tương đồng từ 94,3% cho đến cao nhất là 96,2%.
3.3.2. Kết quả khuếch đại vùng gen matK và giải trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen matK: trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen matK:
Để khuếch đại vùng gen matK, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi matK-1F
và matK-1R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra
đều cho một băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 820 bp tương ứng với kích thước lý thuyết. Điều này chứng tỏ sản phẩm khuếch đại gen bằng cặp mồi matK-1F/matK-1R khá đặc hiệu (hình 3.15).
- Kết quả giải trình tự vùng gen matK:
Để xác đinh trình tự vùng gen matK, sản phẩm PCR được khuếch đại
(hình 3.15) được tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự gen
matK của các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên NCBI (phụ lục
2)và tỉ lệ Nucleotide của các mẫu nghiên cứu vùng gen matK được trình bầy
ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen matK
Tổng số Mẫu Nucle- otide HG1 825 HG2 829 HG3 850 HG4 813 BK 827 LS 821 LC 816 TN 848
có thể xem được ở bảng 3.4. Bên cạnh đó kết quả so sánh trình tự các mẫu nghiên cứu với các mẫu tham chiếu còn chỉ ra các mẫu nghiên cứu đều có khá nhiều điểm sai khác so với các mẫu tham chiếu. Kết quả BLAST các mẫu nghiên cứu với các trình tự có sẵn trên GenBank có mức độ tương đồng với một số trình tự tham chiếu lên tới 98%.
Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen matK của các mẫu nghiên cứu
Kết quả lập cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen matK cho thấy 8 mẫu lan trong nghiên cứu đều bắt nguồn từ một nhánh trên cây phát sinh, trong đó có cả một loài trong các trình tự tham chiếu là
HG1 có quan hệ gần gũi với mẫu BK với giá trị bootstrap là 96, mẫu HG4 có quan hệ gần gũi với mẫu TN với chỉ số bootstrap là 15. Giá trị bootstrap cho thấy độ tin cậy khá thấp đối với cây phân loại.
Hình 3.17 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen matK giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu
Dựa vào bảng hệ số khác biệt di truyền, có thể thấy các mẫu nghiên cứu cũng không có quan hệ họ hàng quá gần với các trình tự tham chiếu, với chỉ số tương đồng giữa mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu thấp nhất là 96,2% và cao nhất là 98,4%.
3.3.3. Kết quả khuếch đại vùng gen rbcL và giải trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen rbcL: trình tự - Kết quả khuếch đại vùng gen rbcL:
Để khuếch đại vùng gen rbcL, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi rbcL-1F
và rbcL-1R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra đều cho một băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 650 bp tương ứng với kích thước lý thuyết. Điều này chứng tỏ sản phẩm khuếch đại gen bằng cặp mồi rbcL-1F/rbcL-1R khá đặc hiệu (hình 3.18).
- Kết quả giải trình tự vùng gen rbcL:
Để xác đinh trình tự vùng gen rbcL, sản phẩm PCR được khuếch đại
(hình 3.18) được tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự gen
rbcL của các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên NCBI (phụ lục
1) và tỉ lệ Nucleotide của các mẫu nghiên cứu vùng gen rcbL được trình bầy ở
bảng 3.5.
Bảng 3.5 Tỉ lệ Nucleotide các mẫu nghiên cứu vùng gen rbcL
Tổng số Mẫu Nucle- otide HG1 642 HG2 641 HG3 640 HG4 641 BK 641 LS 642 LC 639 TN 642
Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng trình tự rbcL của 8 mẫu lan Kim Tuyến trong nghiên cứu cho thấy 8 mẫu lan Kim Tuyến đã được giải trình tự
nghiên cứu với các mẫu tham chiếu còn chỉ ra các mẫu nghiên cứu đều có khá nhiều điểm sai khác so với các mẫu tham chiếu. Kết quả BLAST các mẫu nghiên cứu với các trình tự có sẵn trên GenBank có mức độ tương đồng với một số trình tự tham chiếu lên tới 98%.
Hình 3.19 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen rbcL của các mẫu nghiên cứu
Kết quả lập cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen
rbcL cho thấy 8 mẫu lan trong nghiên cứu không thấy có quan hệ quá gần gũi với các trình tự tham chiếu được lấy từ GenBank. Các mẫu có quan hệ gần gũi với nhau hơn và cây phân loại có giá trị bootstrap thể hiện độ tin cậy khá thấp.
Hình 3.20 Hệ số khác biệt di truyền của vùng gen rbcL giữa các mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu
Dựa vào bảng hệ số khác biệt di truyền, có thể thấy các mẫu nghiên cứu cũng không có quan hệ họ hàng quá gần với các trình tự tham chiếu, với chỉ số tương đồng giữa mẫu nghiên cứu và các trình tự tham chiếu thấp nhất là 97,47% và cao nhất là 98,18%.
Phần 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
• Đánh giá được hình thái của 8 mẫu lan Kim Tuyến thu thập được từ các vùng khác nhau. Các mẫu có ngoại hình tương đối giống nhau về mặt kích thước, hình dáng cây, lá. Những đặc điểm khác nhau rõ ràng có thể kể đến về màu sắc lá, gân lá.
• Phân tích trình tự các vùng gen tương ứng với các mồi sử dụng DNA barcode. Cụ thể:
- Vùng gen ITS phân lập được từ các mẫu có kích thước từ 384 tới 387
bp, tỉ lệ nucleotide giữa các mẫu tương đối giống nhau với A: 23,32-24,02%,
C: 23,38-23,77%, G: 27,13-27,98%, T: 25,06-25,32%. 2 đầu của các mẫu bị nhiễu nên có nhiều sự sai khác, mẫu HG4 có sự sai khác ở trình tự thứ 124 so với các mẫu tham chiếu, mẫu HG2, HG3 có sự sai khác ở vị trí thứ 288 so với các mẫu tham chiếu.
- Vùng gen matK phân lập được từ các mẫu có kích thước từ 813 tới
850 bp, tỉ lệ nucleotide giữa các mẫu có sự khác nhau dao động vào khoảng